Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die weergawe van die blaaier wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste resultate, beveel ons aan dat jy 'n nuwer weergawe van jou blaaier gebruik (of deaktiveer Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer).In die tussentyd, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder stilering of JavaScript.
Die ontdekking en voordelige gebruik van natuurlike produkte kan help om menslike lewe te verbeter.Plantgroei-inhiberende chemikalieë word wyd gebruik as onkruiddoders om onkruid te beheer.Weens die behoefte om verskillende tipes onkruiddoders te gebruik, is daar 'n behoefte om verbindings met nuwe werkingsmeganismes te identifiseer.In hierdie studie het ons 'n nuwe N-alkoksiepirroolverbinding, coumamonamide, van Streptomyces werraensis MK493-CF1 ontdek en die volledige sinteseproses gevestig.Deur middel van biologiese aktiwiteitstoetse het ons ontdek dat urs-monoamiensuur 'n sintetiese intermediêre van urs-monoamied is en 'n potensiëleplantgroei-inhibeerder.Boonop het ons verskeie urbenonzuurderivate ontwikkel, insluitend die urbenieloksi-derivaat (UDA), wat hoë onkruiddodende aktiwiteit het sonder om die groei van HeLa-selle negatief te beïnvloed.Ons het ook gevind dat urmotoniese suurderivate plantmikrotubuli ontwrig;daarbenewens affekteer KAND aktienfilamente en veroorsaak seldood;Hierdie veelvlakkige effekte verskil van dié van bekende mikrotubuli-inhibeerders en stel 'n nuwe meganisme van werking vir ursonsuur voor, wat 'n belangrike voordeel in die ontwikkeling van nuwe onkruiddoders verteenwoordig.
Die ontdekking en praktiese toepassing van voordelige natuurlike produkte en hul afgeleides is 'n manier om die kwaliteit van menslike lewe te verbeter.Sekondêre metaboliete wat deur mikroörganismes, plante en insekte geproduseer word, het gelei tot groot vooruitgang in medisyne en landbou.Baie antibiotika en anti-leukemie middels is ontwikkel uit natuurlike produkte.Daarbenewens, verskeie tipes vanplaagdoders, word swam- en onkruiddoders uit hierdie natuurlike produkte onttrek vir gebruik in die landbou.Veral onkruidbeheer-onkruiddoders is belangrike hulpmiddels om oesopbrengste in die moderne landbou te verhoog, en verskeie tipes verbindings word reeds kommersieel gebruik.Verskeie sellulêre prosesse in plante, soos fotosintese, aminosuurmetabolisme, selwandsintese, regulering van mitose, fitohormoonsein, of proteïensintese, word as tipiese teikens van onkruiddoders beskou.Verbindings wat mikrotubulusfunksie inhibeer is 'n algemene klas onkruiddoders wat plantgroei beïnvloed deur mitotiese regulering te beïnvloed2.
Mikrotubuli is komponente van die sitoskelet en word wyd in eukariotiese selle bewaar.Die tubulien heterodimeer bestaan uit α-tubulien en β-tubulien wat lineêre mikrotubule protofilamente vorm, met 13 protofilamente wat 'n silindriese struktuur vorm.Mikrotubuli speel verskeie rolle in plantselle, insluitend die bepaling van selvorm, seldeling en intrasellulêre vervoer3,4.Plantselle bevat mikrotubuli onder die interfase plasmamembraan, en hierdie sogenaamde kortikale mikrotubuli word vermoedelik die organisasie van sellulose mikrofibrille beheer deur die regulering van sellulose sintase komplekse4,5.Kortikale mikrotubuli van wortel epidermale selle, teenwoordig in die sone van vinnige verlenging van die wortelpunt, is lateraal geleë, en sellulose mikrovesels volg hierdie mikrotubuli en beperk die rigting van seluitsetting, waardeur anisotropiese sel verlenging bevorder word.Daarom is mikrotubulusfunksie nou verwant aan plantmorfologie.Aminosuurvervangings in gene wat vir tubulien kodeer, veroorsaak skeefheid van kortikale mikrotubuli-skikkings en links- of regs-kant groei in Arabidopsis 6,7.Net so kan mutasies in mikrotubuli-geassosieerde proteïene wat mikrotubuli-dinamika reguleer ook lei tot verwronge wortelgroei8,9,10,11,12,13.Daarbenewens veroorsaak behandeling met mikrotubuli-ontwrigtende onkruiddoders soos disopiramied, ook bekend as pretilachlor, ook linkskantige skuinswortelgroei14.Hierdie data dui aan dat presiese regulering van mikrotubulusfunksie krities is vir die bepaling van die rigting van plantgroei.
Verskeie tipes mikrotubuli-inhibeerders is ontdek, en hierdie middels het beduidende bydraes tot sitoskeletale navorsing, sowel as tot landbou en medisyne2 gelewer.In die besonder kan oryzalin, dinitroaniline verbindings, disopiramide, bensamied-verwante verbindings, en hul analoë mikrotubule funksie inhibeer en daardeur plantgroei inhibeer.Daarom word hulle wyd as onkruiddoders gebruik.Aangesien mikrotubuli egter 'n belangrike komponent van plant- en dierselle is, is die meeste mikrotubuli-inhibeerders sitotoksies vir beide seltipes.Daarom, ten spyte van hul erkende nut as onkruiddoders, word 'n beperkte aantal antimikrotubuli-middels vir praktiese doeleindes gebruik.
Streptomyces is 'n genus van die familie Streptomyces, wat aërobiese, gram-positiewe, filamentagtige bakterieë insluit en is wyd bekend vir sy vermoë om 'n wye reeks sekondêre metaboliete te produseer.Daarom word dit beskou as een van die belangrikste bronne van nuwe biologies aktiewe natuurlike produkte.In die huidige studie het ons 'n nuwe verbinding genaamd coumamonamide ontdek, wat geïsoleer is uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Deur spektrale analise en volledige spektrale analise te gebruik, is die struktuur van coumamonamide gekarakteriseer en sy unieke N-alkoxypyrrool skelet was vasbeslote.sintese.Ursmonzuur, 'n sintetiese tussenproduk van ursmonoamied en sy derivate, is gevind om die groei en ontkieming van die gewilde modelplant Arabidopsis thaliana te inhibeer.In 'n struktuur-aktiwiteit-verwantskapstudie het ons gevind dat 'n verbinding met C9 gemodifiseer na ursonsuur, genaamd nonyloxy-derivaat van ursonzuur (KAND), die inhiberende effek op groei en ontkieming aansienlik verhoog.Die nuut ontdekte plantgroei-inhibeerder het veral ook die groei van tabak en lewermos beïnvloed en was nie sitotoksies vir bakterieë of HeLa-selle nie.Boonop veroorsaak sommige urmotoniese suurderivate 'n verwronge wortelfenotipe, wat impliseer dat hierdie derivate direk of indirek mikrotubuli beïnvloed.In ooreenstemming met hierdie idee dui ons waarnemings van mikrotubuli wat óf immunohistochemies óf met fluoresserende proteïene gemerk is, aan dat KAND-behandeling mikrotubuli depolymeriseer.Boonop het behandeling met kumamotonzuurderivate aktienmikrofilamente ontwrig.Ons het dus 'n nuwe plantgroei-inhibeerder ontdek wie se unieke werkingsmeganisme vernietiging van die sitoskelet behels.
Stam MK493-CF1 is geïsoleer uit grond in Shinagawa-ku, Tokio.Stam MK493-CF1 het goed vertakte stromale miselium gevorm.Die gedeeltelike volgorde van die 16S ribosomale RNA geen (1422 bp) is bepaal.Hierdie stam is baie soortgelyk aan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipiese stam, 99.93%).Op grond van hierdie resultaat is vasgestel dat hierdie stam nou verwant is aan die tipe stam van S. werraensis.Daarom het ons hierdie stam voorlopig S. werraensis MK493-CF1 genoem.S. werraensis ISP 5486T produseer ook dieselfde bioaktiewe verbindings.Aangesien daar min vroeë navorsing was oor die verkryging van natuurlike produkte uit hierdie mikro-organisme, is verdere chemiese navorsing gedoen.Na verbouing van S. werraensis MK493-CF1 op garsmedium deur vastestoffermentasie by 30°C vir 14 dae, is die medium met 50% EtOH onttrek.60 ml monster is gedroog om 59,5 mg ru-ekstrak te verkry.Die ru-ekstrak is aan omgekeerde fase HPLC onderwerp om N-metoksi-1H-pirrool-2-karboksamied (1, genoem kumamonamied, 36.0 mg) te gee.Die totale hoeveelheid 1 is ongeveer 60% van die ru-ekstrak.Daarom het ons besluit om die eienskappe van kumamotoamide 1 in detail te bestudeer.
Coumamonamide 1 is 'n wit amorfe poeier en hoë resolusie massaspektrometrie (HRESIMS) bevestig C6H8N2O2 (Fig. 1).Die C2-gesubstitueerde pirroolfragment van hierdie verbinding word gekenmerk deur δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H KMR-spektrum: 4.5 Hz , H-5) en δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), en die 13C KMR-spektrum toon die teenwoordigheid van vier sp2 koolstofatome.Die teenwoordigheid van 'n amiedgroep by die C2 posisie is geassesseer deur HMBC korrelasie vanaf die C-3 proton na die amied karboniel koolstof by δC 161.1.Daarbenewens dui 1H en 13C KMR-pieke by δH 4.10 (3H, S) en δC 68.3 die teenwoordigheid van N-metoksiegroepe in die molekule aan.Alhoewel die korrekte posisie van die metoksiegroep nog nie met behulp van spektroskopiese analise soos verbeterde verskilspektroskopie en kern-Overhauser-afkorting (NOEDF) bepaal is nie, het N-metoksie-1H-pirrool-2-karboksamied die eerste kandidaatverbinding geword.
Om die korrekte struktuur van 1 te bepaal, is 'n totale sintese uitgevoer (Fig. 2a).Behandeling van kommersieel beskikbare 2-aminopiridien 2 met m-CPBA het gelei tot die ooreenstemmende N-oksied 3 in kwantitatiewe opbrengs.Na die 2-aminoazidasie van 2 is die siklokondensasiereaksie wat deur Abramovich beskryf is, in benseen by 90°C uitgevoer om die gewenste 1-hidroksi-1H-pirrool-2-karbonitril 5 in gram te verkry.Spoed 60% (twee fases).15,16.Metilering en hidrolise van 4 het dan 1-metoksi-1H-pirrool-2-karboksielsuur (genoem "cumotonzuur", 6) in goeie opbrengs (70%, twee stappe) gegee.Laastens het amidering via suurchloried-tussenproduk 6 met behulp van waterige ammoniak Kumamoto amied 1 in 98% opbrengs gegee.Alle spektrale data van gesintetiseerde 1 was soortgelyk aan geïsoleerde 1, dus is die struktuur van 1 bepaal;
Algemene sintese en ontleding van die biologiese aktiwiteit van urbenamied en urbeensuur.(a) Totale sintese van Kumamoto amied.(b) Sewe dae oue wilde-tipe Arabidopsis Columbia (Kol) saailinge is op Murashige en Skoog (MS) plate gekweek wat kumamonamied 6 of kumamonamied 1 bevat het by die aangeduide konsentrasies.Skaalstaaf = 1 cm.
Eerstens het ons die biologiese aktiwiteite van urbenamied en sy tussenprodukte beoordeel vir hul vermoë om plantgroei te moduleer.Ons het verskeie konsentrasies ursmonamied 1 of ursmoniese suur 6 by MS agar medium en gekweekte Arabidopsis thaliana saailinge op hierdie medium gevoeg.Hierdie toetse het getoon dat hoë konsentrasies (500 μM) van 6 wortelgroei geïnhibeer het (Fig. 2b).Vervolgens het ons verskeie afgeleides gegenereer deur die N1-posisie van 6 te vervang en struktuur-aktiwiteit-verwantskapstudies daarop uitgevoer (die analoog-sinteseproses word in die Ondersteunende Inligting (SI) beskryf).Arabidopsis saailinge is gekweek op 'n medium wat 50 μM ursonsuur derivate bevat, en wortellengte is gemeet.soos dit op die foto gewys word.Soos getoon in Figure 3a, b en S1, het coumamosure verskillende lengtes van lineêre alkoksiekettings (9, 10, 11, 12 en 13) of groot alkoksiekettings (15, 16 en 17) by die N1-posisie.Die afgeleides het beduidende inhibisie van wortelgroei getoon.Daarbenewens het ons gevind dat toediening van 200 μM 10, 11 of 17 ontkieming geïnhibeer het (Fig. 3c en S2).
Studie van die struktuur-aktiwiteit-verwantskap van Kumamoto-amied en verwante verbindings.(a) Struktuur en sinteseskema van analoë.(b) Kwantifisering van wortellengte van 7 dae oue saailinge wat op MS-medium gekweek is met of sonder 50 μM coumamonamide afgeleides.Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, bl< 0,05).n>18. Data word getoon as gemiddelde ± SD.nt beteken “nie getoets nie” want meer as 50% van die sade het nie ontkiem nie.(c) Kwantifisering van ontkiemingstempo van behandelde sade wat vir 7 dae in MS-medium met of sonder 200 μM coumamonamide en verwante verbindings geïnkubeer is.Sterretjies dui op beduidende verskille met skynbehandeling (chi-kwadraattoets).n=96.
Interessant genoeg het die byvoeging van alkielsykettings langer as C9 die inhiberende aktiwiteit verminder, wat daarop dui dat kumamotoësuurverwante verbindings sykettings van 'n sekere grootte benodig om hul biologiese aktiwiteit te vertoon.
Omdat struktuur-aktiwiteit-verwantskap-analise getoon het dat C9 na ursonsuur gemodifiseer is en die nie-yloksiedrivaat van ursonsuur (hierna verwys as KAND 11) die mees effektiewe plantgroei-inhibeerder was, het ons 'n meer gedetailleerde karakterisering van KAND 11 uitgevoer. Behandeling van Arabidopsis met 50 μM KAND 11 het ontkieming byna heeltemal verhoed, terwyl laer konsentrasies (40, 30, 20 of 10 μM) van KAND 11 wortelgroei op 'n dosis-afhanklike wyse geïnhibeer het (Fig. 4a, b).Om te toets of KAND 11 wortelmeristeem-lewensvatbaarheid beïnvloed, het ons wortelmeristeme wat met propidiumjodied (PI) gekleur is, ondersoek en meristeemoppervlakte-grootte gemeet.Die grootte van die meristeem van saailinge wat gegroei het op 'n medium wat 25 μM KAND-11 bevat was 151.1 ± 32.5 μm, terwyl die grootte van die meristeem van saailinge wat op 'n kontrolemedium wat DMSO gegroei het, 264.7 ± 30.8 μm was (Fig. 4c, d) , wat aandui dat KAND-11 sellulêre aktiwiteit herstel.versprei.Wortel meristeem.In ooreenstemming hiermee het KAND 11-behandeling die hoeveelheid seldelingmerker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-sein in die wortelmeristeem verminder (Fig. 4e) 17.Hierdie resultate dui aan dat KAND 11 wortelgroei inhibeer deur selproliferasie-aktiwiteit te verminder.
Ontleding van die inhiberende effek van urbenonzuurderivate (urbenieloksiderivate) op groei.(a) 7-dae oue wilde-tipe Kol saailinge gekweek op MS plate met die aangeduide konsentrasies van KAND 11. Skaal staaf = 1 cm.(b) Kwantifisering van wortellengte.Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, bl< 0,05).n>16. Data word getoon as gemiddelde ± SD.(c) Konfokale mikroskopie van propidiumjodied-gekleurde wilde-tipe Kol wortels gegroei op MS plate met of sonder 25 μM KAND 11. Wit hakies dui wortel meristeem aan.Skaalstaaf = 100 µm.(d) Kwantifisering van wortelmeristeemgrootte (n = 10 tot 11).Statistiese verskille is bepaal met behulp van t-toets (bl< 0,05).Die stawe verteenwoordig die gemiddelde meristeemgrootte.(e) Differensiële interferensie kontras (DIC) mikroskopie van 'n wortelmeristeem wat die CDKB2 konstruk bevat;1pro: CDKB2;1-GUS gekleur en gekleur op 5-dae oue saailinge wat op MS-plate gekweek is met of sonder 25 µM KAND-toets.
Die fitotoksisiteit van KAND 11 is verder getoets deur gebruik te maak van 'n ander tweesaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en 'n groot landplantmodel organisme, lewermos (Marchantia polymorpha).Soos in die geval van Arabidopsis, het tabak SR-1 saailinge gegroei op medium wat 25 μM KAND 11 bevat, korter wortels geproduseer (Fig. 5a).Daarbenewens het 40 van 48 sade ontkiem op plate wat 200 μM KAND 11 bevat, terwyl al 48 sade op skynbehandelde media ontkiem het, wat aandui dat hoër konsentrasies KAND betekenisvol was (p.< 0,05;chi-toets -vierkant) het die ontkieming van tabak belemmer.(Fig. 5b).Boonop was die konsentrasie van KAND 11 wat bakteriese groei in lewerkruid gerem het soortgelyk aan die effektiewe konsentrasie in Arabidopsis (Fig. 5c).Hierdie resultate dui aan dat KAND 11 die groei van 'n verskeidenheid plante kan inhibeer.Ons het toe die moontlike sitotoksisiteit van beermonoamiedverwante verbindings in ander organismes, naamlik menslike HeLa-selle en Escherichia coli-stam DH5α, as verteenwoordigers van onderskeidelik hoër dier- en bakteriële selle ondersoek.In 'n reeks selproliferasietoetse het ons waargeneem dat kumamonamied 1, kumamonamiedsuur 6 en KAND 11 nie die groei van HeLa- of E. coli-selle by konsentrasies van 100 μM beïnvloed het nie (Fig. 5d, e).
Groei-inhibisie van KAND 11 in nie-Arabidopsis organismes.(a) Twee weke oue wilde-tipe SR-1 tabak saailinge is gekweek op vertikaal geposisioneerde MS plate wat 25 μM KAND 11 bevat. (b) Twee weke oue wilde tipe SR-1 tabak saailinge is gekweek op horisontaal geposisioneerde MS-plate wat 200 μM KAND 11 bevat. (c) Twee weke oue wilde-tipe Tak-1-lewerwortknoppies wat op Gamborg B5-plate gekweek is met die aangeduide konsentrasies van KAND 11. Rooi pyle dui spore aan wat opgehou groei het binne die twee weke lange inkubasie tydperk.(d) Selproliferasietoets van HeLa-selle.Die aantal lewensvatbare selle is met vaste tydintervalle gemeet deur 'n seltelstel 8 (Dojindo) te gebruik.As kontrole is HeLa-selle behandel met 5 μg/ml aktinomisien D (Wet D), wat RNA-polimerase-transkripsie inhibeer en seldood veroorsaak.Ontledings is in drievoud uitgevoer.(e) E. coli-selproliferasietoets.E. coli groei is ontleed deur OD600 te meet.As kontrole is selle behandel met 50 μg/ml ampicillien (Amp), wat bakteriese selwandsintese inhibeer.Ontledings is in drievoud uitgevoer.
Om die werkingsmeganisme van sitotoksisiteit wat deur uramiedverwante verbindings veroorsaak word te ontsyfer, het ons urbeensuurderivate met matige inhiberende effekte herontleed.soos dit op die foto gewys word.Soos getoon in Figure 2b, 6a, het saailinge wat op agarplate gekweek is wat hoë konsentrasies (200 μM) urmotonzuur 6 bevat het, korter en linksgekromde wortels (θ = – 23.7 ± 6.1) geproduseer, terwyl saailinge wat op die kontrolemedium gekweek is, die saailinge het byna reguit wortels geproduseer (θ = – 3.8 ± 7.1).Dit is bekend dat hierdie kenmerkende skuinsgroei voortspruit uit disfunksie van kortikale mikrotubuli14,18.In ooreenstemming met hierdie bevinding, het die mikrotubuli-destabiliserende middels disopiramide en oryzalin soortgelyke wortel kanteling onder ons groeitoestande veroorsaak (Fig. 2b, 6a).Terselfdertyd het ons urmotoniese suurderivate getoets en verskeie daarvan geselekteer wat by sekere konsentrasies skuinswortelgroei veroorsaak het.Verbindings 8, 9 en 15 het die rigting van wortelgroei by onderskeidelik 75 μM, 50 μM en 40 μM verander, wat aandui dat hierdie verbindings mikrotubuli effektief kan destabiliseer (Fig. 2b, 6a).Ons het ook die kragtigste ursoliensuurderivaat, KAND 11, by 'n laer konsentrasie (15 µM) getoets en gevind dat toediening van KAND 11 wortelgroei inhibeer en dat die rigting van wortelgroei ongelyk was, alhoewel hulle geneig was om na links te skuins ( Figuur C3)..Omdat hoër konsentrasies van mikrotubuli-destabiliserende middels soms plantgroei inhibeer eerder as om wortel kantel te veroorsaak, het ons daarna die moontlikheid beoordeel dat KAND 11 mikrotubuli beïnvloed deur kortikale mikrotubuli in wortelepidermale selle waar te neem.Immunohistochemie met behulp van anti-β-tubulien teenliggaampies in epidermale selle van saailingwortels behandel met 25 μM KAND 11 het die verdwyning van byna alle kortikale mikrotubuli in epidermale selle in die verlengingsone getoon (Fig. 6b).Hierdie resultate dui aan dat kumamotonzuur en sy derivate direk of indirek op mikrotubuli inwerk om hulle te ontwrig en dat hierdie verbindings nuwe mikrotubuli-inhibeerders is.
Ursonzuur en sy afgeleides verander kortikale mikrotubuli in Arabidopsis thaliana.(a) Wortelhellingshoek gemeet in die teenwoordigheid van verskeie urmotonzuurderivate by die aangeduide konsentrasies.Die effekte van twee verbindings wat bekend is om mikrotubuli te inhibeer: disopiramide en oryzalin is ook ontleed.Die insetsel toon die standaard wat gebruik word om wortelgroeihoek te meet.Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, bl< 0,05).n>19. Skaalstaaf = 1 cm.(b) Kortikale mikrotubuli in epidermale selle in die verlengingsone.Mikrotubuli in wilde-tipe Arabidopsis Col wortels gegroei op MS plate met of sonder 25 μM KAND 11 is gevisualiseer deur immunohistochemiese kleuring met behulp van β-tubulien primêre teenliggaampies en Alexa Fluor-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies.Skaalstaaf = 10 µm.(c) Mitotiese struktuur van mikrotubuli in die wortelmeristeem.Mikrotubuli is gevisualiseer met behulp van immunohistochemiese kleuring.Mitotiese strukture, insluitend profasesones, spilpunte en fragmoplaste, is vanaf konfokale beelde getel.Pyle dui mitotiese mikrotubuli-strukture aan.Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, bl< 0,05).n>9. Skaalstaaf = 50 µm.
Alhoewel Ursa die vermoë het om mikrotubulusfunksie te ontwrig, word verwag dat die werkingsmeganisme daarvan verskil van tipiese mikrotubuli-depolimeriserende middels.Byvoorbeeld, hoër konsentrasies van mikrotubule-depolimeriserende middels soos disopiramied en oryzalin veroorsaak anisotropiese uitbreiding van epidermale selle, terwyl KAND 11 dit nie doen nie.Daarbenewens het mede-toediening van KAND 11 en disopiramide gelei tot 'n gekombineerde disopiramide-geïnduseerde wortelgroeireaksie en KAND 11-geïnduseerde groei-inhibisie is waargeneem (Fig. S4).Ons het ook die reaksie van die hipersensitiewe disopiramied 1-1 (phs1-1) mutant op KAND 11 ontleed. phs1-1 het 'n nie-kanoniese tubulien kinase punt mutasie en produseer korter wortels wanneer dit met disopiramide9,20 behandel word.phs1-1 mutante saailinge wat op agarmedium gekweek is wat KAND 11 bevat, het korter wortels soortgelyk aan dié wat op disopiramide gekweek is (fig. S5).
Daarbenewens het ons mitotiese mikrotubulistrukture, soos profasesones, spilpunte en fragmoplaste, in die wortelmeristeem van saailinge wat met KAND 11 behandel is, waargeneem. In ooreenstemming met die waarnemings vir CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, 'n betekenisvolle afname in die aantal mitotiese mikrotubuli is waargeneem (Fig. .6c).
Om die sitotoksisiteit van KAND 11 by subsellulêre resolusie te karakteriseer, het ons tabak BY-2 suspensieselle met KAND 11 behandel en hul reaksie waargeneem.Ons het eers KAND 11 by BY-2-selle gevoeg wat TagRFP-TUA6 uitdruk, wat mikrotubuli fluoresserend etiketteer, om die effek van KAND 11 op kortikale mikrotubuli te bepaal.Kortikale mikrotubuli-digtheid is geassesseer met behulp van beeldanalise, wat die persentasie sitoskeletale pixels onder sitoplasmiese pixels gekwantifiseer het.Die toetsresultate het getoon dat na behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 vir 1 uur, die digtheid aansienlik afgeneem het tot onderskeidelik 0.94 ± 0.74% of 0.23 ± 0.28%, terwyl die digtheid van selle wat met DMSO behandel is, 61 ± 10 beloop het. % (Fig. 7a).Hierdie resultate stem ooreen met die waarneming in Arabidopsis dat KAND 11 behandeling depolimerisasie van kortikale mikrotubuli induseer (Fig. 6b).Ons het ook die BY-2-lyn met GFP-ABD-gemerkte aktienfilamente ondersoek na behandeling met dieselfde konsentrasie KAND 11 en waargeneem dat KAND 11 behandeling die aktienfilamente ontwrig het.Behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 vir 1 uur het aktienfilamentdigtheid aansienlik verlaag tot onderskeidelik 1.20 ± 0.62% of 0.61 ± 0.26%, terwyl die digtheid in DMSO-behandelde selle 1.69 ± 0.51% was.7b).Hierdie resultate kontrasteer met die effekte van propisamied, wat nie aktienfilamente affekteer nie, en latrunkulien B, 'n aktien depolimeriseerder wat nie mikrotubuli affekteer nie (SI Figuur S6).Daarbenewens het behandeling met coumamonamide 1, coumamonamide suur 6 of KAND 11 nie mikrotubuli in HeLa-selle beïnvloed nie (SI Figuur S7).Daar word dus geglo dat die werkingsmeganisme van KAND 11 verskil van dié van bekende sitoskeletontwrigters.Daarbenewens het ons mikroskopiese waarneming van BY-2-selle wat met KAND 11 behandel is, die aanvang van seldood tydens KAND 11-behandeling onthul en getoon dat die proporsie Evans-blou-gekleurde dooie selle nie beduidend toegeneem het na 30 minute van KAND 11-behandeling nie, terwyl na 90 minute se behandeling met 50 μM of 100 μM KAND, het die aantal dooie selle tot 43.7% of 80.1% onderskeidelik toegeneem (Fig. 7c).Saamgevat dui hierdie data aan dat die nuwe ursoliensuurderivaat KAND 11 'n plantspesifieke sitoskeletale inhibeerder is met 'n voorheen onbekende werkingsmeganisme.
KAND affekteer kortikale mikrotubuli, aktienfilamente en lewensvatbaarheid van tabak BY-2 selle.(a) Visualisering van kortikale mikrotubuli in BY-2-selle in die teenwoordigheid van TagRFP-TUA6.BY-2 selle behandel met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO is deur konfokale mikroskopie ondersoek.Kortikale mikrotubuli-digtheid is bereken uit mikrograwe van 25 onafhanklike selle.Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, bl< 0,05).Skaalstaaf = 10 µm.(b) Kortikale aktienfilamente in BY-2-selle gevisualiseer in die teenwoordigheid van GFP-ABD2.BY-2 selle behandel met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO is deur konfokale mikroskopie ondersoek.Die digtheid van kortikale aktienfilamente is uit mikrofoto's van 25 onafhanklike selle bereken.Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, bl< 0,05).Skaalstaaf = 10 µm.(c) Waarneming van dooie BY-2 selle deur Evans blou kleuring.BY-2 selle behandel met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO is deur helderveldmikroskopie ondersoek.n=3.Skaalstaaf = 100 µm.
Die ontdekking en toepassing van nuwe natuurlike produkte het gelei tot aansienlike vooruitgang in verskeie aspekte van die menslike lewe, insluitend medisyne en landbou.Historiese navorsing is uitgevoer om bruikbare verbindings uit natuurlike hulpbronne te verkry.Dit is veral bekend dat aktinomisete bruikbaar is as antiparasitiese antibiotika vir aalwurms as gevolg van hul vermoë om verskeie sekondêre metaboliete soos avermektien, die hoofverbinding van ivermektien en bleomisien en sy derivate, wat medisinaal as 'n teenkankermiddel gebruik word, te produseer21,22.Net so is 'n verskeidenheid onkruiddodende verbindings van aktinomisete ontdek, waarvan sommige reeds kommersieel gebruik word1,23.Daarom word die ontleding van aktinomisetmetaboliete om natuurlike produkte met gewenste biologiese aktiwiteite te isoleer as 'n effektiewe strategie beskou.In hierdie studie het ons 'n nuwe verbinding, coumamonamide, van S. werraensis ontdek en dit suksesvol gesintetiseer.Ursonzuur is 'n sintetiese tussenproduk van urbenamied en sy derivate.Dit kan kenmerkende wortelkrul veroorsaak, matige tot sterk onkruiddodende aktiwiteit vertoon en plantmikrotubuli direk of indirek beskadig.Die werkingsmeganisme van urmotonzuur kan egter verskil van dié van bestaande mikrotubuli-inhibeerders, aangesien KAND 11 ook aktienfilamente ontwrig en seldood veroorsaak, wat 'n regulatoriese meganisme voorstel waardeur urmotonzuur en sy afgeleides 'n wye reeks sitoskeletale strukture beïnvloed..
Verdere gedetailleerde karakterisering van urbenonzuur sal help om die werkingsmeganisme van urbenonsuur beter te verstaan.Die volgende doelwit is veral om die vermoë van ursonsuur om aan verminderde mikrotubuli te bind, te evalueer om te bepaal of ursonzuur en sy derivate direk op mikrotubuli inwerk en dit depolimeriseer, en of hul werking tot mikrotubuli-destabilisering lei.Daarbenewens, in die geval waar mikrotubuli nie 'n direkte teiken is nie, sal die identifisering van die plek van werking en molekulêre teikens van ursonzuur op plantselle help om die eienskappe van verwante verbindings en moontlike maniere om onkruiddodende aktiwiteit te verbeter verder te verstaan.Ons bioaktiwiteitstoets het die unieke sitotoksiese vermoë van ursonzuur op die groei van plante soos Arabidopsis thaliana, tabak en lewerkruid onthul, terwyl nóg E. coli nóg HeLa-selle aangetas is.Min of geen toksisiteit vir dierselle is 'n voordeel van ursonsuurderivate as dit ontwikkel word as onkruiddoders vir gebruik in oop landbouvelde.Inderdaad, aangesien mikrotubuli algemene strukture in eukariote is, is hul selektiewe inhibisie in plante 'n sleutelvereiste vir onkruiddoders.Propisamied, 'n mikrotubuli-depolimeriserende middel wat direk aan tubulien bind en polimerisasie inhibeer, word byvoorbeeld as 'n onkruiddoder gebruik weens die lae toksisiteit daarvan vir dierselle24.In teenstelling met disopiramied, het verwante bensamiede verskillende teikenspesifisiteite.Benewens plantmikrotubuli, inhibeer RH-4032 of bensoksamied ook mikrotubuli van dierselle of oomysete, onderskeidelik, en salilamied word as 'n swamdoder gebruik as gevolg van sy lae fitotoksisiteit25,26,27.Die nuut ontdekte beer en sy afgeleides toon selektiewe sitotoksisiteit teen plante, maar dit is opmerklik dat verdere modifikasies hul teikenspesifisiteit kan verander, wat moontlik addisionele afgeleides vir die beheer van patogeniese swamme of oomysete kan verskaf.
Die unieke eienskappe van urbenonzuur en sy afgeleides is nuttig vir die ontwikkeling daarvan as onkruiddoders en gebruik as navorsingsinstrumente.Die belangrikheid van die sitoskelet in die beheer van plantselvorm word algemeen erken.Vroeëre studies het getoon dat plante komplekse meganismes van kortikale mikrotubuli-organisasie ontwikkel het deur mikrotubuli-dinamika te beheer om morfogenese behoorlik te beheer.'n Groot aantal molekules wat verantwoordelik is vir die regulering van mikrotubule-aktiwiteit is geïdentifiseer, en verwante navorsing is steeds aan die gang3,4,28.Ons huidige begrip van mikrotubuli-dinamika in plantselle verduidelik nie die meganismes van kortikale mikrotubuli-organisasie volledig nie.Byvoorbeeld, alhoewel beide disopiramied en oryzalin mikrotubuli kan depolimeriseer, veroorsaak disopiramide ernstige wortelvervorming terwyl oryzalin 'n relatief ligte effek het.Boonop veroorsaak mutasies in tubulien, wat mikrotubuli stabiliseer, ook dekstrorotasie in wortels, terwyl paclitaxel, wat ook mikrotubuli-dinamika stabiliseer, dit nie doen nie.Daarom behoort die bestudering en identifisering van die molekulêre teikens van ursoliensuur nuwe insigte te verskaf in die regulering van plantkortikale mikrotubuli.Net so sal toekomstige vergelykings van chemikalieë wat effektief is om verwronge groei te bevorder, soos disopiramied, en minder effektiewe chemikalieë, soos oryzalin of kumamotoriese suur, leidrade verskaf oor hoe verwronge groei plaasvind.
Aan die ander kant is verdedigingsverwante sitoskeletale herrangskikkings nog 'n moontlikheid om die sitotoksisiteit van ursonsuur te verklaar.Infeksie van 'n patogeen of inbring van 'n opwekker in plantselle veroorsaak soms vernietiging van die sitoskelet en daaropvolgende seldood29.Daar is byvoorbeeld berig dat oomyceet-afgeleide kriptoksantien mikrotubuli en aktienfilamente ontwrig voor tabakseldood, soortgelyk aan wat met KAND-behandeling voorkom30,31.Die ooreenkomste tussen verdedigingsreaksies en sellulêre reaksies wat deur ursonsuur geïnduseer word, het ons laat vermoed dat hulle algemene sellulêre prosesse veroorsaak, hoewel 'n vinniger en sterker effek van ursonsuur as kriptoksantien sigbaar is.Studies het egter getoon dat ontwrigting van aktienfilamente spontane seldood bevorder, wat nie altyd met mikrotubulusontwrigting gepaard gaan nie29.Daarbenewens moet nog gesien word of óf die patogeen óf die opwekker verwronge wortelgroei veroorsaak, soos ursonsuurderivate doen.Molekulêre kennis wat verdedigingsreaksies en die sitoskelet verbind is dus 'n aantreklike probleem wat aangespreek moet word.Deur die teenwoordigheid van verbindings met 'n lae molekulêre gewig wat met ursonsuur verband hou, sowel as 'n reeks derivate met verskillende kragte te benut, kan hulle geleenthede bied om onbekende sellulêre meganismes te teiken.
Saamgevat, sal die ontdekking en toepassing van nuwe verbindings wat mikrotubuli-dinamika moduleer kragtige metodes verskaf om die komplekse molekulêre meganismes onderliggend aan plantselvormbepaling aan te spreek.In hierdie konteks kan die onlangs ontwikkelde saamgestelde urmotonzuur, wat mikrotubuli en aktienfilamente affekteer en seldood veroorsaak, 'n geleentheid bied om die verband tussen mikrotubulibeheer en hierdie ander meganismes te ontsyfer.Chemiese en biologiese ontledings met behulp van urbenonzuur sal ons dus help om die molekulêre reguleringsmeganismes wat die plantsitoskelet beheer, te verstaan.
Ent S. werraensis MK493-CF1 in 'n 500 ml verwarde Erlenmeyer-fles wat 110 ml saadmedium bevat wat bestaan uit 2% (w/v) galaktose, 2% (w/v) Essence-pasta, 1% (w/v) Bacto-samestelling .-sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) mielieekstrak (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 en 0.2% CaCO3 in gedeïoniseerde water.(pH 7.4 voor sterilisasie).Die saadkulture is vir 2 dae op 'n roterende skudder (180 rpm) by 27°C geïnkubeer.Produksieverbouing via vastestoffermentasie.Die saadkultuur (7 ml) is oorgeplaas in 'n 500 ml K-1-fles wat 40 g produksiemedium bevat wat bestaan het uit 15 g geparste gars (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g gedeïoniseerde water (pH nie aangepas) voor sterilisasie).).Fermentasie is vir 14 dae by 30°C in die donker uitgevoer.Die fermentasiemateriaal is met 40 ml/bottel EtOH onttrek en gesentrifugeer (1500 g, 4°C, 10 min).Die kultuursupernatant (60 ml) is met 'n mengsel van 10% MeOH/EtOAc onttrek.Die organiese laag is onder verminderde druk verdamp om 'n oorblyfsel (59.5 mg) te verkry, wat aan HPLC met gradiëntelueer (0–10 minute: 90%) op 'n omgekeerde fasekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID onderwerp is) 10 mm × lengte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN tot 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O /EtOH tot 100% EtOH (gradiënt (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) teen 'n vloeitempo van 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) is geïsoleer as 'n wit amorfe poeier.
Kumamotoamide(1);1H-KMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-KMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekende waarde: 141.0659, gemete waarde: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593,–15.
Columbia-sade (Kol-0) is verkry van die Arabidopsis Biologiese Hulpbronsentrum (ABRC) met toestemming vir navorsingsgebruik.Kol-0-sade is gepropageer en onder ons laboratoriumtoestande onderhou en as wilde-tipe Arabidopsis-plante gebruik.Arabidopsis sade is oppervlak gesteriliseer en gekweek in halfsterkte Murashige en Skoog medium wat 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etaansulfonsuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) bevat het ).) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, by 23 °C en konstante lig.Sade van die phs1-1 mutant is deur T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) verskaf.
Sade van stam SR-1 is deur T. Hashimoto (Nara Instituut vir Wetenskap en Tegnologie) verskaf en as wilde-tipe tabakplante gebruik.Tabaksaad is oppervlak gesteriliseer en vir drie nagte in steriele water geweek om ontkieming te bevorder, dan geplaas in 'n halfsterkte oplossing wat 2% sukrose, 0,05% (w/v) MES en 0,8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) bevat het. Murashige.en Skoog-medium) met pH 5.7 en by 23°C onder konstante lig geïnkubeer.
Stam Tak-1 is verskaf deur T. Kohchi (Kyoto Universiteit) en is gebruik as die standaard eksperimentele eenheid vir die lewermosstudie.Gemma is verkry van gesteriliseerde gekweekte plante en dan uitgeplaat op Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) wat 1% sukrose en 0.3% gellangom bevat en by 23°C onder deurlopende lig geïnkubeer.
Tabak BY-2 selle (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) is verskaf deur S. Hasezawa (Universiteit van Tokio).BY-2 selle is 95-voudig verdun in gemodifiseerde Linsmeier en Skoog medium en weekliks aangevul met 2,4-dichloorfenoksiasynsuur 32.Die selsuspensie is gemeng op 'n roterende skudder teen 130 rpm by 27°C in die donker.Was selle met 10 keer die volume vars medium en hersuspendeer in dieselfde medium.BY-2 transgeniese sellyne wat die mikrotubule merker TagRFP-TUA6 of die aktien filament merker GFP-ABD2 onder die blomkool mosaïek virus 35S promotor stabiel uitdruk, is gegenereer soos beskryf33,34,35.Hierdie sellyne kan onderhou en gesinchroniseer word deur gebruik te maak van prosedures soortgelyk aan dié wat vir die oorspronklike BY-2-sellyn gebruik word.
HeLa-selle is gekweek in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) aangevul met 10% fetale bees serum, 1.2 U/ml penisillien, en 1.2 μg/ml streptomisien in 'n 37°C broeikas met 5% CO2.
Alle eksperimente wat in hierdie manuskrip beskryf word, is uitgevoer in ooreenstemming met Japannese bioveiligheidsregulasies en -riglyne.
Verbindings is opgelos in dimetielsulfoksied (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) as voorraadoplossings en verdun in MS-medium vir Arabidopsis en tabak of Gamborg B5-medium vir lewermos.Vir die wortelgroei-inhibisie-toets is meer as 10 sade per plaat op agarmedium gesaai wat die aangeduide verbindings of DMSO bevat.Saad is vir 7 dae in 'n groeikamer geïnkubeer.Die saailinge is gefotografeer en die lengte van die wortels is gemeet.Vir Arabidopsis-ontkiemingstoets is 48 sade per plaat gesaai op agarmedium wat 200 μM verbinding of DMSO bevat.Arabidopsis-sade is in 'n groeikamer gekweek en die aantal ontkiemde saailinge is 7 dae na ontkieming (dag) getel.Vir tabakontkiemingstoets is 24 sade per plaat gesaai op agarmedium wat 200 μM KAND of DMSO bevat.Tabaksaad is in 'n groeikamer gekweek en die aantal ontkiemde saailinge is na 14 dae getel.Vir die lewerkruidgroei-inhibisie-toets is 9 embrio's van elke plaat op agarmedium uitgeplaat wat die aangeduide konsentrasies van KAND of DMSO bevat en vir 14 dae in 'n groeikamer geïnkubeer.
Gebruik saailinge wat met 5 mg/ml propidiumjodied (PI) gekleur is om wortelmeristeem-organisasie te visualiseer.PI seine is waargeneem deur fluoressensiemikroskopie met behulp van 'n TCS SPE konfokale laserskanderingsmikroskoop (Leica Microsystems).
Histochemiese kleuring van wortels met β-glukuronidase (GUS) is uitgevoer volgens die protokol beskryf deur Malami en Benfey36.Saailinge is oornag in 90% asetoon gefixeer, gekleur met 0.5 mg/ml 5-broom-4-chloor-3-indoliel-β-d-glukuronzuur in GUS buffer vir 1 uur en geplaas in 'n gehidreerde chloraldehied oplossing.(8 g chloraalhidraat, 2 ml water en 1 ml gliserol) en waargeneem deur differensiële interferensie kontrasmikroskopie met behulp van 'n Axio Imager M1 mikroskoop (Carl Zeiss).
Wortelhoeke is gemeet op 7 dae oue saailinge wat op vertikaal geplaasde plate gekweek is.Meet die hoek van die wortel vanaf die rigting van die swaartekragvektor soos beskryf in stap 6.
Die rangskikking van kortikale mikrotubuli is waargeneem soos beskryf, met geringe wysigings aan die protokol 37.Anti-β-tubulien teenliggaampies (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-gekonjugeerde anti-muis IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) is gebruik as primêre en sekondêre teenliggaampies teen 1:1000 en 1:100 verdunnings, onderskeidelik.Fluoresensiebeelde is verkry met behulp van 'n TCS SPE konfokale laserskanderingsmikroskoop (Leica Microsystems).Verkry Z-stapel beelde en skep maksimum intensiteit projeksies volgens die vervaardiger se instruksies.
HeLa-selproliferasie-toets is uitgevoer met behulp van Sel Telling Kit 8 (Dojindo) volgens die vervaardiger se instruksies.
Die groei van E. coli DH5α is ontleed deur seldigtheid in kultuur te meet met behulp van 'n spektrofotometer by 600 nm (OD600).
Sitoskeletorganisasie in transgeniese BY-2-selle is waargeneem met behulp van 'n fluoressensiemikroskoop toegerus met 'n CSU-X1 konfokale skanderingstoestel (Yokogawa) en 'n sCMOS-kamera (Zyla, Andor Tegnologie).Sitoskeletdigtheid is beoordeel deur beeldanalise, wat die persentasie sitoskeletale piksels onder sitoplasmiese piksels in konfokale beelde gekwantifiseer het met behulp van ImageJ sagteware soos beskryf38,39.
Om seldood in BY-2-selle op te spoor, is 'n aliquot van die selsuspensie vir 10 minute by kamertemperatuur met 0.05% Evans blue geïnkubeer.Selektiewe Evans-blou kleuring van dooie selle hang af van ekstrudering van die kleurstof uit lewensvatbare selle deur die ongeskonde plasmamembraan40.Gekleurde selle is waargeneem met behulp van 'n helderveldmikroskoop (BX53, Olympus).
HeLa-selle is gekweek in DMEM aangevul met 10% FBS in 'n bevochtigde broeikas by 37°C en 5% CO2.Selle is behandel met 100 μM KAND 11, kumamonamiensuur 6, kumamonamied 1, 100 ng/ml kolcemied (Gibco), of 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) vir 6 uur by 37°C.Selle is gefixeer met MetOH vir 10 min en dan met asetaat vir 5 min by kamertemperatuur.Gefixeerde selle is geïnkubeer met β-tubulien primêre teenliggaampies (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdun in 0.5% BSA/PBS vir 2 uur, 3 keer gewas met TBST, en dan geïnkubeer met Alexa Fluor bok teenliggaampies.488 1 uur.– Muis IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) verdun in 0,5% BSA/PBS.Na drie keer met TBST gewas is, is gekleurde selle op 'n Nikon Eclipse Ti-E omgekeerde mikroskoop waargeneem.Beelde is geneem met 'n afgekoelde Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera deur MetaMorph-sagteware (Molecular Devices) te gebruik.
Pos tyd: Jun-17-2024