Dankie dat u Nature.com besoek het. Die weergawe van die blaaier wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste resultate beveel ons aan dat u 'n nuwer weergawe van u blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder stilering of JavaScript.
Die ontdekking en voordelige gebruik van natuurlike produkte kan help om menslike lewe te verbeter. Plantgroei-inhiberende chemikalieë word wyd gebruik as onkruiddoders om onkruid te beheer. As gevolg van die behoefte om verskillende tipes onkruiddoders te gebruik, is daar 'n behoefte om verbindings met nuwe werkingsmeganismes te identifiseer. In hierdie studie het ons 'n nuwe N-alkoksipirroolverbinding, coumamonamied, van Streptomyces werraensis MK493-CF1 ontdek en die volledige sinteseproses gevestig. Deur biologiese aktiwiteitstoetse het ons ontdek dat urs-monoamiensuur 'n sintetiese tussenproduk van urs-monomied is en 'n potensiële ...plantgroei-inhibeerderDaarbenewens het ons verskeie urbenoonsuurderivate ontwikkel, insluitend die urbeniloksiederivaat (UDA), wat hoë onkruiddodende aktiwiteit het sonder om die groei van HeLa-selle negatief te beïnvloed. Ons het ook gevind dat urmotonsuurderivate plantmikrotubuli ontwrig; boonop beïnvloed KAND aktienfilamente en veroorsaak seldood; Hierdie veelsydige effekte verskil van dié van bekende mikrotubuli-inhibeerders en dui op 'n nuwe werkingsmeganisme vir ursonsuur, wat 'n belangrike voordeel in die ontwikkeling van nuwe onkruiddoders verteenwoordig.
Die ontdekking en praktiese toepassing van voordelige natuurprodukte en hul afgeleides is 'n manier om die kwaliteit van menslike lewe te verbeter. Sekondêre metaboliete wat deur mikroörganismes, plante en insekte geproduseer word, het gelei tot groot vooruitgang in medisyne en landbou. Baie antibiotika en anti-leukemie-middels is uit natuurprodukte ontwikkel. Daarbenewens word verskeie tipesplaagdoders, swamdoders en onkruiddoders word uit hierdie natuurlike produkte onttrek vir gebruik in die landbou. Onkruidbeheer-onkruiddoders is veral belangrike instrumente om gewasopbrengste in moderne landbou te verhoog, en verskeie tipes verbindings word reeds kommersieel gebruik. Verskeie sellulêre prosesse in plante, soos fotosintese, aminosuurmetabolisme, selwandsintese, regulering van mitose, fitohormoonseintransduksie of proteïensintese, word as tipiese teikens van onkruiddoders beskou. Verbindings wat mikrotubulusfunksie inhibeer, is 'n algemene klas onkruiddoders wat plantgroei beïnvloed deur mitotiese regulering te beïnvloed.
Mikrotubuli is komponente van die sitoskelet en word wyd behoue gebly in eukariotiese selle. Die tubuli-heterodimeer bestaan uit α-tubuli en β-tubuli wat lineêre mikrotubuli-protofilamente vorm, met 13 protofilamente wat 'n silindriese struktuur vorm. Mikrotubuli speel verskeie rolle in plantselle, insluitend die bepaling van selvorm, seldeling en intrasellulêre vervoer3,4. Plantselle bevat mikrotubuli onder die interfase-plasmamembraan, en daar word geglo dat hierdie sogenaamde kortikale mikrotubuli die organisasie van sellulose-mikrofibrille beheer deur die regulering van sellulose-sintase-komplekse4,5. Kortikale mikrotubuli van wortel-epidermale selle, teenwoordig in die sone van vinnige verlenging van die wortelpunt, is lateraal geleë, en sellulose-mikrovesels volg hierdie mikrotubuli en beperk die rigting van seluitbreiding, waardeur anisotropiese selverlenging bevorder word. Daarom is mikrotubuli-funksie nou verwant aan plantmorfologie. Aminosuursubstitusies in gene wat vir tubulien kodeer, veroorsaak skeeftrekking van kortikale mikrotubuli-skikkings en links- of regssydige groei in Arabidopsis 6,7. Net so kan mutasies in mikrotubuli-geassosieerde proteïene wat mikrotubuli-dinamika reguleer, ook lei tot verwronge wortelgroei8,9,10,11,12,13. Daarbenewens veroorsaak behandeling met mikrotubuli-ontwrigtende onkruiddoders soos disopiramied, ook bekend as pretilachlor, ook linkssydige skuins wortelgroei14. Hierdie data dui daarop dat presiese regulering van mikrotubuli-funksie van kritieke belang is om die rigting van plantgroei te bepaal.
Verskeie tipes mikrotubuli-inhibeerders is ontdek, en hierdie middels het beduidende bydraes gelewer tot sitoskeletnavorsing, sowel as tot landbou en medisyne2. In die besonder kan oryzalin, dinitroanilienverbindings, disopiramied, bensamiedverwante verbindings en hul analoë mikrotubulifunksie inhibeer en sodoende plantgroei inhibeer. Daarom word hulle wyd gebruik as onkruiddoders. Aangesien mikrotubuli egter 'n belangrike komponent van plant- en dierselle is, is die meeste mikrotubuli-inhibeerders sitotoksies vir beide seltipes. Daarom, ten spyte van hul erkende nut as onkruiddoders, word 'n beperkte aantal antimikrotubuli-middels vir praktiese doeleindes gebruik.
Streptomyces is 'n genus van die familie Streptomyces, wat aërobiese, gram-positiewe, filamentagtige bakterieë insluit en wyd bekend is vir sy vermoë om 'n wye reeks sekondêre metaboliete te produseer. Daarom word dit beskou as een van die belangrikste bronne van nuwe biologies aktiewe natuurprodukte. In die huidige studie het ons 'n nuwe verbinding genaamd coumamonamied ontdek, wat geïsoleer is uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Deur gebruik te maak van spektrale analise en volledige spektrale analise, is die struktuur van coumamonamied gekarakteriseer en die unieke N-alkoksipirroolskelet is bepaal. Ursmonsuur, 'n sintetiese tussenproduk van ursmonomamied en sy derivate, is gevind om die groei en ontkieming van die gewilde modelplant Arabidopsis thaliana te inhibeer. In 'n struktuur-aktiwiteit-verwantskapstudie het ons gevind dat 'n verbinding met C9 gemodifiseer na ursonsuur, genaamd noniloksiderivaat van ursonsuur (KAND), die inhiberende effek op groei en ontkieming aansienlik verbeter. Dit is opmerklik dat die nuut ontdekte plantgroei-inhibeerder ook die groei van tabak en lewermos beïnvloed het en nie sitotoksies vir bakterieë of HeLa-selle was nie. Boonop veroorsaak sommige urmotoniese suurderivate 'n verwronge wortelfenotipe, wat impliseer dat hierdie derivate direk of indirek mikrotubuli beïnvloed. In ooreenstemming met hierdie idee, dui ons waarnemings van mikrotubuli wat óf immunohistochemies óf met fluorescerende proteïene gemerk is, daarop dat KAND-behandeling mikrotubuli depolymeriseer. Daarbenewens het behandeling met kumamotonsuurderivate aktien-mikrofilamente ontwrig. Dus het ons 'n nuwe plantgroei-inhibeerder ontdek waarvan die unieke werkingsmeganisme die vernietiging van die sitoskelet behels.
Stam MK493-CF1 is uit grond in Shinagawa-ku, Tokio, geïsoleer. Stam MK493-CF1 het goed vertakte stromale miselium gevorm. Die gedeeltelike volgorde van die 16S ribosomale RNA-geen (1422 bp) is bepaal. Hierdie stam is baie soortgelyk aan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipiese stam, 99.93%). Gebaseer op hierdie resultaat, is bepaal dat hierdie stam nou verwant was aan die tipe stam van S. werraensis. Daarom het ons hierdie stam voorlopig S. werraensis MK493-CF1 genoem. S. werraensis ISP 5486T produseer ook dieselfde bioaktiewe verbindings. Aangesien daar min vroeë navorsing was oor die verkryging van natuurlike produkte van hierdie mikro-organisme, is verdere chemiese navorsing uitgevoer. Na kweek van S. werraensis MK493-CF1 op garsmedium deur vastetoestandfermentasie by 30°C vir 14 dae, is die medium met 50% EtOH geëkstrak. 60 ml van die monster is gedroog om 59.5 mg ru-ekstrak te verkry. Die ru-ekstrak is aan omgekeerde fase HPLC onderwerp om N-metoksi-1H-pirrool-2-karboksamied (1, genaamd coumamonamied, 36.0 mg) te gee. Die totale hoeveelheid van 1 is ongeveer 60% van die ru-ekstrak. Daarom het ons besluit om die eienskappe van kumamotamied 1 in detail te bestudeer.
Coumamonamied 1 is 'n wit amorfe poeier en hoë-resolusie massaspektrometrie (HRESIMS) bevestig C6H8N2O2 (Fig. 1). Die C2-gesubstitueerde pirroolfragment van hierdie verbinding word gekenmerk deur δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H NMR-spektrum: 4.5 Hz, H-5) en δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), en die 13C NMR-spektrum toon die teenwoordigheid van vier sp2 koolstofatome. Die teenwoordigheid van 'n amiedgroep by die C2-posisie is bepaal deur HMBC-korrelasie van die C-3 proton na die amiedkarbonielkoolstof by δC 161.1. Daarbenewens dui 1H- en 13C-NMR-pieke by δH 4.10 (3H, S) en δC 68.3 op die teenwoordigheid van N-metoksigroepe in die molekule. Alhoewel die korrekte posisie van die metoksigroep nog nie bepaal is met behulp van spektroskopiese analise soos verbeterde verskilspektroskopie en kern-Overhauser-afkorting (NOEDF) nie, het N-metoksi-1H-pirrool-2-karboksamied die eerste kandidaatverbinding geword.
Om die korrekte struktuur van 1 te bepaal, is 'n totale sintese uitgevoer (Fig. 2a). Behandeling van kommersieel beskikbare 2-aminopiridien 2 met m-CPBA het gelei tot die ooreenstemmende N-oksied 3 in kwantitatiewe opbrengs. Na die 2-aminoasidasie van 2, is die siklokondensasiereaksie wat deur Abramovich beskryf word, in benseen by 90°C uitgevoer om die verlangde 1-hidroksi-1H-pirrool-2-karbonitriel 5 in gram te verkry. Spoed 60% (twee stadiums). 15,16. Metilering en hidrolise van 4 het toe 1-metoksi-1H-pirrool-2-karboksielsuur (genoem "kumotoniese suur", 6) in goeie opbrengs (70%, twee stappe) gegee. Laastens het amidasie via suurchloried-tussenproduk 6 met behulp van waterige ammoniak Kumamoto-amied 1 in 98% opbrengs gegee. Alle spektrale data van gesintetiseerde 1 was soortgelyk aan geïsoleerde 1, dus is die struktuur van 1 bepaal;
Algemene sintese en analise van die biologiese aktiwiteit van urbenamied en urbensuur. (a) Totale sintese van Kumamoto-amied. (b) Sewe dae oue wilde-tipe Arabidopsis Columbia (Col) saailinge is gekweek op Murashige en Skoog (MS) plate wat coumamonamied 6 of coumamonamied 1 bevat teen die aangeduide konsentrasies. Skaalbalk = 1 cm.
Eerstens het ons die biologiese aktiwiteite van urbenamied en sy tussenprodukte beoordeel vir hul vermoë om plantgroei te moduleer. Ons het verskillende konsentrasies ursmonamied 1 of ursmonsuur 6 by MS-agarmedium gevoeg en Arabidopsis thaliana-saailinge op hierdie medium gekweek. Hierdie toetse het getoon dat hoë konsentrasies (500 μM) van 6 wortelgroei geïnhibeer het (Fig. 2b). Vervolgens het ons verskeie derivate gegenereer deur die N1-posisie van 6 te vervang en struktuur-aktiwiteit-verwantskapstudies daarop uitgevoer (die analoog-sinteseproses word in die Aanvullende Inligting (SI) beskryf). Arabidopsis-saailinge is gekweek op 'n medium wat 50 μM ursonsuurderivate bevat, en die wortellengte is gemeet, soos op die prentjie getoon. Soos getoon in Figure 3a, b en S1, het coumamo-sure verskillende lengtes van lineêre alkoksiekettings (9, 10, 11, 12 en 13) of groot alkoksiekettings (15, 16 en 17) by die N1-posisie. Die derivate het beduidende inhibisie van wortelgroei getoon. Daarbenewens het ons gevind dat die toediening van 200 μM 10, 11 of 17 ontkieming geïnhibeer het (Fig. 3c en S2).
Studie van die struktuur-aktiwiteit-verwantskap van Kumamoto-amied en verwante verbindings. (a) Struktuur- en sinteseskema van analoë. (b) Kwantifisering van wortellengte van 7 dae oue saailinge wat op MS-medium met of sonder 50 μM coumamonamiedderivate gekweek is. Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, p< 0.05). n>18. Data word as gemiddeld ± SD getoon. nt beteken "nie getoets nie" omdat meer as 50% van die sade nie ontkiem het nie. (c) Kwantifisering van die ontkiemingstempo van behandelde sade wat vir 7 dae in MS-medium met of sonder 200 μM coumamonamied en verwante verbindings geïnkubeer is. Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling (chi-kwadraattoets) aan. n=96.
Interessant genoeg het die byvoeging van alkiel-sykettings langer as C9 die inhiberende aktiwiteit verminder, wat daarop dui dat kumamotoïensuurverwante verbindings sykettings van 'n sekere grootte benodig om hul biologiese aktiwiteit te vertoon.
Omdat struktuur-aktiwiteit-verhoudingsanalise getoon het dat C9 na ursonsuur gemodifiseer is en die noniloksiederivaat van ursonsuur (hierna verwys as KAND 11) die mees effektiewe plantgroei-inhibeerder was, het ons 'n meer gedetailleerde karakterisering van KAND 11 uitgevoer. Behandeling van Arabidopsis met 50 μM KAND 11 het ontkieming byna heeltemal voorkom, terwyl laer konsentrasies (40, 30, 20 of 10 μM) van KAND 11 wortelgroei op 'n dosisafhanklike wyse geïnhibeer het (Fig. 4a, b). Om te toets of KAND 11 die lewensvatbaarheid van wortelmeristeme beïnvloed, het ons wortelmeristeme wat met propidiumjodied (PI) gekleur is, ondersoek en die meristeemoppervlaktegrootte gemeet. Die grootte van die meristeem van saailinge wat op 'n medium wat 25 μM KAND-11 bevat, gekweek is, was 151.1 ± 32.5 μm, terwyl die grootte van die meristeem van saailinge wat op 'n kontrolemedium wat DMSO bevat, gekweek is, 264.7 ± 30.8 μm was (Fig. 4c, d), wat aandui dat KAND-11 sellulêre aktiwiteit herstel. Wortelmeristeem. In ooreenstemming hiermee het KAND 11-behandeling die hoeveelheid selverdelingsmerker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-sein in die wortelmeristeem verminder (Fig. 4e) 17. Hierdie resultate dui daarop dat KAND 11 wortelgroei inhibeer deur selproliferasie-aktiwiteit te verminder.
Analise van die inhiberende effek van urbenonsuurderivate (urbeniloksiderivate) op groei. (a) 7-dae oue wildetipe Col-saailinge gekweek op MS-plate met die aangeduide konsentrasies van KAND 11. Skaalbalk = 1 cm. (b) Kwantifisering van wortellengte. Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, p< 0.05). n>16. Data word getoon as gemiddeld ± SD. (c) Konfokale mikroskopie van propidiumjodied-gekleurde wilde-tipe Col-wortels gekweek op MS-plate met of sonder 25 μM KAND 11. Wit hakies dui wortelmeristeem aan. Skaalbalk = 100 µm. (d) Kwantifisering van wortelmeristeemgrootte (n = 10 tot 11). Statistiese verskille is bepaal met behulp van t-toets (p< 0.05). Die stawe verteenwoordig die gemiddelde meristeemgrootte. (e) Differensiële interferensiekontras (DIC) mikroskopie van 'n wortelmeristeem wat die CDKB2-konstruk bevat; 1pro: CDKB2; 1-GUS gekleur en gekleur op 5-dae oue saailinge wat op MS-plate gekweek is met of sonder 25 µM KAND-toets.
Die fitotoksisiteit van KAND 11 is verder getoets met behulp van 'n ander tweesaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en 'n belangrike landplantmodelorganisme, lewermos (Marchantia polymorpha). Soos in die geval van Arabidopsis, het tabak SR-1-saailinge wat op medium wat 25 μM KAND 11 bevat, gekweek is, korter wortels geproduseer (Fig. 5a). Daarbenewens het 40 van 48 sade op plate wat 200 μM KAND 11 bevat, ontkiem, terwyl al 48 sade op namaakbehandelde media ontkiem het, wat aandui dat hoër konsentrasies KAND beduidend was (p< 0.05; chi-toets -vierkant) het die ontkieming van tabak geïnhibeer. (Fig. 5b). Daarbenewens was die konsentrasie van KAND 11 wat bakteriële groei in lewermos geïnhibeer het, soortgelyk aan die effektiewe konsentrasie in Arabidopsis (Fig. 5c). Hierdie resultate dui daarop dat KAND 11 die groei van 'n verskeidenheid plante kan inhibeer. Ons het toe die moontlike sitotoksisiteit van beermonomiedverwante verbindings in ander organismes ondersoek, naamlik menslike HeLa-selle en Escherichia coli-stam DH5α, as verteenwoordigers van hoër dier- en bakteriële selle, onderskeidelik. In 'n reeks selproliferasie-toetse het ons waargeneem dat coumamonamied 1, coumamonamidiensuur 6 en KAND 11 nie die groei van HeLa- of E. coli-selle by konsentrasies van 100 μM beïnvloed het nie (Fig. 5d,e).
Groei-inhibisie van KAND 11 in nie-Arabidopsis organismes. (a) Twee weke oue wilde-tipe SR-1 tabaksaailinge is gekweek op vertikaal geplaasde MS-plate wat 25 μM KAND 11 bevat. (b) Twee weke oue wilde-tipe SR-1 tabaksaailinge is gekweek op horisontaal geplaasde MS-plate wat 200 μM KAND 11 bevat. (c) Twee weke oue wilde-tipe Tak-1 lewermosknoppies gekweek op Gamborg B5-plate met die aangeduide konsentrasies van KAND 11. Rooi pyle dui spore aan wat opgehou groei het binne die twee weke lange inkubasieperiode. (d) Selproliferasie-toets van HeLa-selle. Die aantal lewensvatbare selle is gemeet met vaste tydsintervalle met behulp van 'n selvelterstel 8 (Dojindo). As 'n kontrole is HeLa-selle behandel met 5 μg/ml aktinomisien D (Akt D), wat RNA-polimerase-transkripsie inhibeer en seldood veroorsaak. Analises is in drievoud uitgevoer. (e) E. coli-selproliferasie-toets. E. coli-groei is geanaliseer deur OD600 te meet. As 'n kontrole is selle behandel met 50 μg/ml ampisillien (Amp), wat bakteriële selwandsintese inhibeer. Analises is in drievoud uitgevoer.
Om die werkingsmeganisme van sitotoksisiteit wat deur uramiedverwante verbindings veroorsaak word, te ontsyfer, het ons urbeensuurderivate met matige inhiberende effekte heranaliseer, soos in die prentjie getoon. Soos getoon in Figure 2b, 6a, het saailinge wat op agarplate gekweek is wat hoë konsentrasies (200 μM) urmotonsuur 6 bevat, korter en linksgeboë wortels geproduseer (θ = – 23.7 ± 6.1), terwyl van saailinge wat op die kontrolemedium gekweek is, die saailinge amper reguit wortels geproduseer het (θ = – 3.8 ± 7.1). Hierdie kenmerkende skuins groei is bekend as die gevolg van disfunksie van kortikale mikrotubuli14,18. In ooreenstemming met hierdie bevinding het die mikrotubuli-destabiliserende middels disopiramied en oryzalin soortgelyke wortelkanteling onder ons groeitoestande veroorsaak (Fig. 2b, 6a). Terselfdertyd het ons urmotonsuurderivate getoets en verskeie daarvan gekies wat, teen sekere konsentrasies, skuins wortelgroei veroorsaak het. Verbindings 8, 9 en 15 het die rigting van wortelgroei verander teen onderskeidelik 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat aandui dat hierdie verbindings mikrotubuli effektief kan destabiliseer (Fig. 2b, 6a). Ons het ook die kragtigste ursoliese suurderivaat, KAND 11, teen 'n laer konsentrasie (15 μM) getoets en gevind dat die toediening van KAND 11 wortelgroei geïnhibeer het en dat die rigting van wortelgroei ongelyk was, alhoewel hulle geneig was om na links te helling (Figuur C3). Omdat hoër konsentrasies van mikrotubuli-destabiliserende middels soms plantgroei inhibeer eerder as om wortelkanteling te veroorsaak, het ons vervolgens die moontlikheid beoordeel dat KAND 11 mikrotubuli beïnvloed deur kortikale mikrotubuli in wortel-epidermale selle waar te neem. Immunohistochemie met behulp van anti-β-tubulien-teenliggaampies in epidermale selle van saailingwortels wat met 25 μM KAND 11 behandel is, het die verdwyning van byna alle kortikale mikrotubuli in epidermale selle in die verlengingsone getoon (Fig. 6b). Hierdie resultate dui daarop dat kumamotonsuur en sy derivate direk of indirek op mikrotubuli inwerk om hulle te ontwrig en dat hierdie verbindings nuwe mikrotubuli-inhibeerders is.
Ursonsuur en sy derivate verander kortikale mikrotubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Wortelhellingshoek gemeet in die teenwoordigheid van verskeie urmotonsuurderivate teen die aangeduide konsentrasies. Die effekte van twee verbindings wat bekend is om mikrotubuli te inhibeer: disopiramied en oryzalin, is ook geanaliseer. Die insetsel toon die standaard wat gebruik word om wortelgroeihoek te meet. Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, p< 0.05). n>19. Skaalbalk = 1 cm. (b) Kortikale mikrotubuli in epidermale selle in die verlengingsone. Mikrotubuli in wilde-tipe Arabidopsis Col wortels gekweek op MS-plate met of sonder 25 μM KAND 11 is gevisualiseer deur immunohistochemiese kleuring met behulp van β-tubulien primêre teenliggaampies en Alexa Fluor-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies. Skaalbalk = 10 µm. (c) Mitotiese struktuur van mikrotubuli in die wortelmeristeem. Mikrotubuli is gevisualiseer met behulp van immunohistochemiese kleuring. Mitotiese strukture, insluitend profasesones, spindels en fragmoplaste, is getel vanaf konfokale beelde. Pyle dui mitotiese mikrotubulistrukture aan. Sterretjies dui beduidende verskille met skynbehandeling aan (t-toets, p< 0.05). n>9. Skaalbalk = 50 µm.
Alhoewel Ursa die vermoë het om mikrotubuli-funksie te ontwrig, word verwag dat die werkingsmeganisme daarvan anders sal wees as tipiese mikrotubuli-depolimeriserende middels. Byvoorbeeld, hoër konsentrasies mikrotubuli-depolimeriserende middels soos disopiramied en oryzalin veroorsaak anisotropiese uitbreiding van epidermale selle, terwyl KAND 11 dit nie doen nie. Daarbenewens het die gesamentlike toediening van KAND 11 en disopiramied gelei tot 'n gekombineerde disopiramied-geïnduseerde wortelgroeirespons en KAND 11-geïnduseerde groei-inhibisie is waargeneem (Fig. S4). Ons het ook die reaksie van die hipersensitiewe disopiramied 1-1 (phs1-1) mutant op KAND 11 geanaliseer. phs1-1 het 'n nie-kanonieke tubulien kinase puntmutasie en produseer korter wortels wanneer dit met disopiramied behandel word9,20. phs1-1 mutant saailinge wat op agarmedium wat KAND 11 bevat, gekweek is, het korter wortels soortgelyk aan dié wat op disopiramied gekweek is (fig. S5).
Daarbenewens het ons mitotiese mikrotubuli-strukture, soos profasesones, spindels en fragmoplaste, in die wortelmeristeem van saailinge wat met KAND 11 behandel is, waargeneem. In ooreenstemming met die waarnemings vir CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, is 'n beduidende afname in die aantal mitotiese mikrotubuli waargeneem (Fig. .6c).
Om die sitotoksisiteit van KAND 11 by subsellulêre resolusie te karakteriseer, het ons tabak BY-2 suspensie selle met KAND 11 behandel en hul reaksie waargeneem. Ons het eers KAND 11 by BY-2 selle gevoeg wat TagRFP-TUA6 uitdruk, wat mikrotubuli fluoresserend merk, om die effek van KAND 11 op kortikale mikrotubuli te bepaal. Kortikale mikrotubuli digtheid is bepaal deur middel van beeldanalise, wat die persentasie sitoskeletale pixels onder sitoplasmiese pixels gekwantifiseer het. Die toetsresultate het getoon dat na behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 vir 1 uur, die digtheid beduidend afgeneem het tot onderskeidelik 0.94 ± 0.74% of 0.23 ± 0.28%, terwyl die digtheid van selle wat met DMSO behandel is, 1.61 ± 0.34% beloop het (Fig. 7a). Hierdie resultate stem ooreen met die waarneming in Arabidopsis dat KAND 11 behandeling depolimerisasie van kortikale mikrotubuli veroorsaak (Fig. 6b). Ons het ook die BY-2-lyn met GFP-ABD-gemerkte aktienfilamente ondersoek na behandeling met dieselfde konsentrasie KAND 11 en waargeneem dat KAND 11-behandeling die aktienfilamente ontwrig het. Behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 vir 1 uur het die aktienfilamendigtheid aansienlik verminder tot onderskeidelik 1.20 ± 0.62% of 0.61 ± 0.26%, terwyl die digtheid in DMSO-behandelde selle 1.69 ± 0.51% was (Fig. 2). 7b). Hierdie resultate kontrasteer met die effekte van propisamied, wat nie aktienfilamente beïnvloed nie, en latrunkulien B, 'n aktiendepolimerisator wat nie mikrotubuli beïnvloed nie (SI Figuur S6). Daarbenewens het behandeling met coumamonamied 1, coumamonamiedsuur 6, of KAND 11 nie mikrotubuli in HeLa-selle beïnvloed nie (SI Figuur S7). Dus word geglo dat die werkingsmeganisme van KAND 11 verskil van dié van bekende sitoskeletontwrigters. Daarbenewens het ons mikroskopiese waarneming van BY-2-selle wat met KAND 11 behandel is, die aanvang van seldood tydens KAND 11-behandeling aan die lig gebring en getoon dat die proporsie Evans-blougekleurde dooie selle nie beduidend toegeneem het na 30 minute se KAND 11-behandeling nie, terwyl die aantal dooie selle na 90 minute se behandeling met 50 μM of 100 μM KAND tot onderskeidelik 43,7% of 80,1% toegeneem het (Fig. 7c). Saamgevat dui hierdie data daarop dat die nuwe ursoliese suurderivaat KAND 11 'n plantspesifieke sitoskeletinhibeerder is met 'n voorheen onbekende werkingsmeganisme.
KAND beïnvloed kortikale mikrotubuli, aktienfilamente en lewensvatbaarheid van tabak BY-2-selle. (a) Visualisering van kortikale mikrotubuli in BY-2-selle in die teenwoordigheid van TagRFP-TUA6. BY-2-selle wat met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO behandel is, is deur konfokale mikroskopie ondersoek. Kortikale mikrotubuli-digtheid is bereken uit mikrograwe van 25 onafhanklike selle. Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, p< 0.05). Skaalbalk = 10 µm. (b) Kortikale aktienfilamente in BY-2-selle gevisualiseer in die teenwoordigheid van GFP-ABD2. BY-2-selle behandel met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO is ondersoek deur konfokale mikroskopie. Die digtheid van kortikale aktienfilamente is bereken uit mikrograwe van 25 onafhanklike selle. Letters dui beduidende verskille aan (Tukey HSD-toets, p< 0.05). Skaalbalk = 10 µm. (c) Waarneming van dooie BY-2-selle deur Evans-bloukleuring. BY-2-selle behandel met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO is ondersoek deur helderveldmikroskopie. n=3. Skaalbalk = 100 µm.
Die ontdekking en toepassing van nuwe natuurlike produkte het gelei tot beduidende vooruitgang in verskeie aspekte van die menslike lewe, insluitend medisyne en landbou. Historiese navorsing is uitgevoer om nuttige verbindings uit natuurlike hulpbronne te verkry. In die besonder is aktinomisete bekend as nuttig as antiparasitiese antibiotika vir nematodes as gevolg van hul vermoë om verskeie sekondêre metaboliete te produseer, soos avermektien, die hoofverbinding van ivermektien en bleomisien en sy derivate, wat medisinaal as 'n antikankermiddel gebruik word21,22. Net so is 'n verskeidenheid onkruiddodende verbindings uit aktinomisete ontdek, waarvan sommige reeds kommersieel gebruik word1,23. Daarom word die analise van aktinomisetmetaboliete om natuurlike produkte met gewenste biologiese aktiwiteite te isoleer as 'n effektiewe strategie beskou. In hierdie studie het ons 'n nuwe verbinding, coumamonamied, uit S. werraensis ontdek en dit suksesvol gesintetiseer. Ursonsuur is 'n sintetiese tussenproduk van urbenamied en sy derivate. Dit kan kenmerkende wortelkrul veroorsaak, matige tot sterk onkruiddodende aktiwiteit toon, en plantmikrotubuli direk of indirek beskadig. Die werkingsmeganisme van urmotonsuur kan egter verskil van dié van bestaande mikrotubuli-inhibeerders, aangesien KAND 11 ook aktienfilamente ontwrig en seldood veroorsaak, wat dui op 'n regulatoriese meganisme waardeur urmotonsuur en sy derivate 'n wye reeks sitoskeletale strukture beïnvloed.
Verdere gedetailleerde karakterisering van urbenonsuur sal help om die werkingsmeganisme van urbenonsuur beter te verstaan. In die besonder is die volgende doelwit om die vermoë van ursonsuur te evalueer om aan gereduseerde mikrotubuli te bind om te bepaal of ursonsuur en sy derivate direk op mikrotubuli inwerk en hulle depolimeriseer, of of hul werking lei tot mikrotubuli-destabilisering. Boonop, in die geval waar mikrotubuli nie 'n direkte teiken is nie, sal die identifisering van die werkingsplek en molekulêre teikens van ursonsuur op plantselle help om die eienskappe van verwante verbindings en moontlike maniere om onkruiddodende aktiwiteit te verbeter, verder te verstaan. Ons bioaktiwiteitstoets het die unieke sitotoksiese vermoë van ursonsuur op die groei van plante soos Arabidopsis thaliana, tabak en lewermos aan die lig gebring, terwyl nóg E. coli nóg HeLa-selle beïnvloed is. Min of geen toksisiteit vir dierselle is 'n voordeel van ursonsuurderivate as hulle as onkruiddoders ontwikkel word vir gebruik in oop landbouvelde. Inderdaad, aangesien mikrotubuli algemene strukture in eukariote is, is hul selektiewe inhibisie in plante 'n sleutelvereiste vir onkruiddoders. Byvoorbeeld, propisamied, 'n mikrotubuli-depolimeriserende middel wat direk aan tubulien bind en polimerisasie inhibeer, word as 'n onkruiddoder gebruik as gevolg van die lae toksisiteit daarvan vir dierselle24. In teenstelling met disopiramied, het verwante bensamiede verskillende teikenspesifisiteite. Benewens plantmikrotubuli, inhibeer RH-4032 of bensoksamied ook mikrotubuli van dierselle of oomisete, onderskeidelik, en zalilamied word as 'n swamdoder gebruik as gevolg van die lae fitotoksisiteit25,26,27. Die nuut ontdekte beer en sy derivate toon selektiewe sitotoksisiteit teen plante, maar dit is die moeite werd om daarop te let dat verdere modifikasies hul teikenspesifisiteit kan verander, wat moontlik addisionele derivate vir die beheer van patogene swamme of oomisete kan verskaf.
Die unieke eienskappe van urbenonsuur en sy derivate is nuttig vir hul ontwikkeling as onkruiddoders en gebruik as navorsingsinstrumente. Die belangrikheid van die sitoskelet in die beheer van plantselvorm word wyd erken. Vroeëre studies het getoon dat plante komplekse meganismes van kortikale mikrotubuli-organisasie ontwikkel het deur mikrotubuli-dinamika te beheer om morfogenese behoorlik te beheer. 'n Groot aantal molekules wat verantwoordelik is vir die regulering van mikrotubuli-aktiwiteit is geïdentifiseer, en verwante navorsing is steeds aan die gang3,4,28. Ons huidige begrip van mikrotubuli-dinamika in plantselle verduidelik nie die meganismes van kortikale mikrotubuli-organisasie volledig nie. Byvoorbeeld, hoewel beide disopiramied en oryzalin mikrotubuli kan depolimeriseer, veroorsaak disopiramied ernstige wortelvervorming terwyl oryzalin 'n relatief ligte effek het. Boonop veroorsaak mutasies in tubulien, wat mikrotubuli stabiliseer, ook dekstrorotasie in wortels, terwyl paklitaksel, wat ook mikrotubuli-dinamika stabiliseer, dit nie doen nie. Daarom behoort die bestudering en identifisering van die molekulêre teikens van ursoliese suur nuwe insigte te bied in die regulering van plantkortikale mikrotubuli. Net so sal toekomstige vergelykings van chemikalieë wat effektief is in die bevordering van verwronge groei, soos disopiramied, en minder effektiewe chemikalieë, soos oryzalin of kumamotorsuur, leidrade gee oor hoe verwronge groei plaasvind.
Aan die ander kant is verdedigingsverwante sitoskelet-herrangskikkings nog 'n moontlikheid om die sitotoksisiteit van ursonsuur te verduidelik. Infeksie van 'n patogeen of die inbring van 'n elisitor in plantselle veroorsaak soms die vernietiging van die sitoskelet en daaropvolgende seldood29. Byvoorbeeld, oomyset-afgeleide kriptoksantien is berig om mikrotubuli en aktienfilamente te ontwrig voor tabakseldood, soortgelyk aan wat met KAND-behandeling plaasvind30,31. Die ooreenkomste tussen verdedigingsreaksies en sellulêre reaksies wat deur ursonsuur geïnduseer word, het ons gelei tot die hipotese dat hulle algemene sellulêre prosesse veroorsaak, hoewel 'n vinniger en sterker effek van ursonsuur as kriptoksantien duidelik is. Studies het egter getoon dat ontwrigting van aktienfilamente spontane seldood bevorder, wat nie altyd gepaard gaan met mikrotubuli-ontwrigting29 nie. Daarbenewens moet nog gesien word of die patogeen of elisitor verwronge wortelgroei veroorsaak, soos ursonsuurderivate doen. Dus is molekulêre kennis wat verdedigingsreaksies en die sitoskelet verbind, 'n aantreklike probleem om aan te spreek. Deur die teenwoordigheid van lae molekulêre gewigverbindings wat verband hou met uroonsuur, sowel as 'n reeks derivate met verskillende sterktes, te benut, kan hulle geleenthede bied om onbekende sellulêre meganismes te teiken.
Saamgevat sal die ontdekking en toepassing van nuwe verbindings wat mikrotubuli-dinamika moduleer, kragtige metodes bied om die komplekse molekulêre meganismes onderliggend aan plantselvormbepaling aan te spreek. In hierdie konteks kan die onlangs ontwikkelde verbinding urmotoniese suur, wat mikrotubuli en aktienfilamente beïnvloed en seldood veroorsaak, 'n geleentheid bied om die verband tussen mikrotubulibeheer en hierdie ander meganismes te ontsyfer. Dus sal chemiese en biologiese analise met behulp van urbenoonsuur ons help om die molekulêre regulatoriese meganismes wat die plantsitoskelet beheer, te verstaan.
Ent S. werraensis MK493-CF1 in 'n 500 mL Erlenmeyer-fles met 'n baffle, wat 110 mL saadmedium bevat, bestaande uit 2% (g/v) galaktose, 2% (g/v) essensiepasta, 1% (g/v) Bacto-samestelling. -sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (g/v) mielie-ekstrak (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (g/v) (NH4)2SO4 en 0.2% CaCO3 in gedeïoniseerde water (pH 7.4 voor sterilisasie). Die saadkulture is vir 2 dae op 'n roterende skudder (180 rpm) by 27°C geïnkubeer. Produksiekultivering via vastetoestandfermentasie. Die saadkultuur (7 ml) is oorgedra na 'n 500 ml K-1-fles wat 40 g produksiemedium bevat, bestaande uit 15 g geperste gars (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g gedeïoniseerde water (pH nie aangepas voor sterilisasie nie). Fermentasie is vir 14 dae by 30°C in die donker uitgevoer. Die fermentasiemateriaal is met 40 ml EtOH/bottel geëkstraheer en gesentrifugeer (1500 g, 4°C, 10 min). Die kultuursupernatant (60 ml) is met 'n mengsel van 10% MeOH/EtOAc geëkstraheer. Die organiese laag is onder verminderde druk verdamp om 'n residu (59.5 mg) te verkry, wat aan HPLC met gradiënteluering (0–10 minute: 90%) op 'n omgekeerde fasekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN tot 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O/EtOH tot 100% EtOH (gradiënt (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) teen 'n vloeitempo van 1.5 ml/min onderwerp is. Coumamonamied (1, 36.0 mg) is as 'n wit amorfe poeier geïsoleer.
Kumamotoamied(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekende waarde: 141.0659, gemete waarde: 141.0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-sade (Col-0) is verkry van die Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) met toestemming vir navorsingsgebruik. Col-0-sade is gekweek en onderhou onder ons laboratoriumtoestande en gebruik as wilde-tipe Arabidopsis-plante. Arabidopsis-sade is oppervlakgesteriliseer en gekweek in halfsterkte Murashige- en Skoog-medium wat 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (g/v) 2-(4-morfolino)etaansulfonsuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) en 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, by 23 °C en konstante lig bevat. Sade van die phs1-1-mutant is verskaf deur T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Saad van stam SR-1 is verskaf deur T. Hashimoto (Nara Instituut vir Wetenskap en Tegnologie) en as wildetipe tabakplante gebruik. Tabaksaad is oppervlakgesteriliseer en vir drie nagte in steriele water geweek om ontkieming te bevorder, en toe in 'n halfsterkte-oplossing geplaas wat 2% sukrose, 0.05% (g/v) MES en 0.8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. en Skoog-medium) met pH 5.7 bevat, en by 23°C onder konstante lig geïnkubeer.
Stam Tak-1 is verskaf deur T. Kohchi (Universiteit van Kyoto) en is as die standaard eksperimentele eenheid vir die lewermosstudie gebruik. Gemma is verkry van gesteriliseerde gekweekte plante en toe op Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) wat 1% sukrose en 0.3% gellangom bevat, uitgeplaat en by 23°C onder deurlopende lig geïnkubeer.
Tabak BY-2 selle (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) is verskaf deur S. Hasezawa (Universiteit van Tokio). BY-2 selle is 95-voudig verdun in gemodifiseerde Linsmeier en Skoog medium en weekliks aangevul met 2,4-dichlorofenoksiasynsuur 32. Die selsuspensie is gemeng op 'n roterende skudder teen 130 rpm by 27°C in die donker. Was selle met 10 keer die volume vars medium en resuspendeer in dieselfde medium. BY-2 transgeniese sellyne wat stabiel die mikrotubule merker TagRFP-TUA6 of die aktienfilament merker GFP-ABD2 onder die blomkoolmosaïekvirus 35S promotor uitdruk, is gegenereer soos beskryf 33,34,35. Hierdie sellyne kan gehandhaaf en gesinkroniseer word deur prosedures soortgelyk aan dié wat vir die oorspronklike BY-2 sellyne gebruik word.
HeLa-selle is gekweek in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle-medium (DMEM) (Life Technologies) aangevul met 10% fetale beeserum, 1.2 U/ml penisillien en 1.2 μg/ml streptomisien in 'n 37°C-inkubeerder met 5% CO2.
Alle eksperimente wat in hierdie manuskrip beskryf word, is uitgevoer in ooreenstemming met Japannese bioveiligheidsregulasies en -riglyne.
Verbindings is opgelos in dimetielsulfoksied (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) as voorraadoplossings en verdun in MS-medium vir Arabidopsis en tabak- of Gamborg B5-medium vir lewermos. Vir die wortelgroei-inhibisie-toets is meer as 10 sade per plaat gesaai op agarmedium wat die aangeduide verbindings of DMSO bevat. Sade is vir 7 dae in 'n groeikamer geïnkubeer. Die saailinge is gefotografeer en die lengte van die wortels is gemeet. Vir die Arabidopsis-ontkiemingstoets is 48 sade per plaat gesaai op agarmedium wat 200 μM verbinding of DMSO bevat. Arabidopsis-sade is in 'n groeikamer gekweek en die aantal ontkiemde saailinge is 7 dae na ontkieming (dag) getel. Vir die tabakontkiemingstoets is 24 sade per plaat gesaai op agarmedium wat 200 μM KAND of DMSO bevat. Tabaksaad is in 'n groeikamer gekweek en die aantal ontkiemde saailinge is na 14 dae getel. Vir die lewermosgroei-inhibisie-toets is 9 embrio's van elke plaat op agarmedium wat die aangeduide konsentrasies KAND of DMSO bevat, geplaas en vir 14 dae in 'n groeikamer geïnkubeer.
Gebruik saailinge gekleur met 5 mg/ml propidiumjodied (PI) om wortelmeristeemorganisasie te visualiseer. PI-seine is waargeneem deur fluoresensiemikroskopie met behulp van 'n TCS SPE konfokale laserskandeermikroskoop (Leica Microsystems).
Histochemiese kleuring van wortels met β-glukuronidase (GUS) is uitgevoer volgens die protokol wat deur Malami en Benfey36 beskryf is. Saailinge is oornag in 90% asetoon gefikseer, vir 1 uur met 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indoliel-β-d-glukuronsuur in GUS-buffer gekleur en in 'n gehidreerde chloraldehiedoplossing (8 g chloraalhidraat, 2 ml water en 1 ml gliserol) geplaas en waargeneem deur differensiële interferensiekontrasmikroskopie met behulp van 'n Axio Imager M1-mikroskoop (Carl Zeiss).
Wortelhoeke is gemeet op 7 dae oue saailinge wat op vertikaal geplaasde plate gekweek is. Meet die hoek van die wortel vanaf die rigting van die swaartekragvektor soos beskryf in stap 6.
Die rangskikking van kortikale mikrotubuli is waargeneem soos beskryf, met geringe wysigings aan die protokol 37. Anti-β-tubulien-teenliggaam (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-gekonjugeerde anti-muis IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) is as primêre en sekondêre teenliggaampies gebruik teen onderskeidelik 1:1000 en 1:100 verdunnings. Fluoresensiebeelde is verkry met behulp van 'n TCS SPE konfokale laserskandeermikroskoop (Leica Microsystems). Verkry Z-stapelbeelde en skep maksimum intensiteitsprojeksies volgens die vervaardiger se instruksies.
HeLa-selproliferasie-toets is uitgevoer met behulp van Cell Counting Kit 8 (Dojindo) volgens die vervaardiger se instruksies.
Die groei van E. coli DH5α is geanaliseer deur seldigtheid in kultuur te meet met behulp van 'n spektrofotometer teen 600 nm (OD600).
Sitoskeletale organisasie in transgeniese BY-2-selle is waargeneem met behulp van 'n fluoresensiemikroskoop toegerus met 'n CSU-X1 konfokale skanderingsapparaat (Yokogawa) en 'n sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology). Sitoskeletale digtheid is bepaal deur beeldanalise, wat die persentasie sitoskeletale pixels onder sitoplasmiese pixels in konfokale beelde gekwantifiseer het met behulp van ImageJ-sagteware soos beskryf38,39.
Om seldood in BY-2-selle op te spoor, is 'n aliquot van die selsuspensie vir 10 minute by kamertemperatuur met 0.05% Evans-blou geïnkubeer. Selektiewe Evans-bloukleuring van dooie selle hang af van die ekstrusie van die kleurstof uit lewensvatbare selle deur die intakte plasmamembraan40. Gekleurde selle is waargeneem met behulp van 'n helderveldmikroskoop (BX53, Olympus).
HeLa-selle is gekweek in DMEM aangevul met 10% FBS in 'n bevogtigde inkubator by 37°C en 5% CO2. Selle is behandel met 100 μM KAND 11, kumamonamiensuur 6, kumamonamied 1, 100 ng/ml kolcemied (Gibco), of 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) vir 6 uur by 37°C. Selle is gefikseer met MetOH vir 10 min en dan met asetaat vir 5 min by kamertemperatuur. Gefikseerde selle is geïnkubeer met β-tubulien primêre teenliggaam (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdun in 0.5% BSA/PBS vir 2 uur, gewas 3 keer met TBST, en dan geïnkubeer met Alexa Fluor bok-teenliggaam. 488 1 uur. – Muis-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenielindool (DAPI) verdun in 0.5% BSA/PBS. Nadat dit drie keer met TBST gewas is, is gekleurde selle waargeneem op 'n Nikon Eclipse Ti-E omgekeerde mikroskoop. Beelde is vasgelê met 'n afgekoelde Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera met behulp van MetaMorph-sagteware (Molecular Devices).
Plasingstyd: 17 Junie 2024