Die dennenematode is 'n kwarantyn-migrerende endoparasiet wat bekend is daarvoor dat dit ernstige ekonomiese verliese in dennebos-ekosisteme veroorsaak. Die huidige studie hersien die nematodedodende aktiwiteit van gehalogeneerde indole teen dennenematode en hul werkingsmeganisme. Die nematodedodende aktiwiteite van 5-jodoindool en avermektien (positiewe kontrole) teen dennenematode was soortgelyk en hoog teen lae konsentrasies (10 μg/ml). 5-jodoindool het vrugbaarheid, reproduktiewe aktiwiteit, embrioniese en larwale mortaliteit, en lokomotoriese gedrag verminder. Molekulêre interaksies van ligande met ongewerwelde-spesifieke glutamaat-beheerde chloriedkanaalreseptore ondersteun die idee dat 5-jodoindool, soos avermektien, styf aan die reseptor se aktiewe plek bind. 5-Jodoindool het ook verskeie fenotipiese vervormings in nematodes veroorsaak, insluitend abnormale orgaanineenstorting/krimping en verhoogde vakuolisering. Hierdie resultate dui daarop dat vakuole 'n rol kan speel in nematode-metilering-gemedieerde dood. Dit is belangrik dat 5-jodoindool nie-giftig was vir beide plantspesies (kool en radyse). Hierdie studie toon dus aan dat die toediening van jodoindool onder omgewingstoestande denneverwelking kan beheer.
Dennehoutaalwurm (Bursaphelenchus xylophilus) behoort tot die dennehoutaalwurm (PWN), migrerende endoparasitiese nematodes wat bekend is daarvoor dat hulle ernstige ekologiese skade aan dennebos-ekosisteme veroorsaak1. Denneverwelkingsiekte (PWD) wat deur die dennehoutaalwurm veroorsaak word, word 'n ernstige probleem op verskeie kontinente, insluitend Asië en Europa, en in Noord-Amerika vernietig die nematode ingevoerde dennespesies1,2. Die agteruitgang van dennebome is 'n groot ekonomiese probleem, en die vooruitsig van die wêreldwye verspreiding daarvan is kommerwekkend3. Die volgende dennespesies word die meeste deur die nematode aangeval: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, en Pinus radiata4. Dennehoutaalwurm is 'n ernstige siekte wat dennebome binne weke of maande na infeksie kan doodmaak. Daarbenewens is uitbrake van dennehoutaalwurm algemeen in 'n verskeidenheid ekosisteme, dus is volgehoue infeksiekettings gevestig1.
Bursaphelenchus xylophilus is 'n kwarantyn plant-parasitiese nematode wat behoort aan die superfamilie Aphelenchoidea en klade 102.5. Die nematode voed op swamme en reproduseer in die houtweefsel van dennebome, en ontwikkel in vier verskillende larfstadiums: L1, L2, L3, L4 en 'n volwasse individu1,6. Onder toestande van voedseltekort gaan die dennenematode oor in 'n gespesialiseerde larfstadium – dauer, wat sy vektor – die dennebaskewer (Monochamus alternatus) – parasiteer en na gesonde dennebome oorgedra word. In gesonde gashere migreer nematodes vinnig deur plantweefsels en voed op parenchiemagtige selle, wat lei tot 'n aantal hipersensitiwiteitsreaksies, denneverwelking en dood binne 'n jaar na infeksie1,7,8.
Biologiese beheer van dennenematodes was lank reeds 'n uitdaging, met kwarantynmaatreëls wat terugdateer na die 20ste eeu. Huidige strategieë vir die beheer van dennenematodes behels hoofsaaklik chemiese behandelings, insluitend houtberoking en die inplanting van nematodes in boomstamme. Die mees gebruikte nematodes is avermektien en avermektienbensoaat, wat tot die avermektienfamilie behoort. Hierdie duur chemikalieë is hoogs effektief teen baie nematodespesies en word as omgewingsveilig beskou9. Herhaalde gebruik van hierdie nematodes sal egter na verwagting seleksiedruk skep wat byna sekerlik sal lei tot die opkoms van weerstandbiedende dennenematodes, soos gedemonstreer is vir verskeie insekplae, soos Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella en die nematodes Trichostrongylus colubriformis en Ostertagia circumcincta, wat geleidelik weerstand teen avermektiene ontwikkel het10,11,12. Daarom moet weerstandspatrone gereeld bestudeer word en nematodedoders voortdurend gekeur word om alternatiewe, koste-effektiewe en omgewingsvriendelike maatreëls te vind om PVD te beheer. In onlangse dekades het 'n aantal outeurs die gebruik van plantekstrakte, essensiële olies en vlugtige stowwe as nematodebeheermiddels voorgestel13,14,15,16.
Ons het onlangs die nematodesidale aktiwiteit van indool, 'n intersellulêre en interkoninkryk-seinmolekule, in Caenorhabditis elegans 17 gedemonstreer. Indol is 'n wydverspreide intrasellulêre sein in mikrobiese ekologie wat talle funksies beheer wat mikrobiese fisiologie, spoorvorming, plasmiedstabiliteit, geneesmiddelweerstand, biofilmvorming en virulensie 18, 19 beïnvloed. Die aktiwiteit van indool en sy derivate teen ander patogene nematodes is nog nie bestudeer nie. In hierdie studie het ons die nematodesidale aktiwiteit van 34 indole teen dennenematodes ondersoek en die werkingsmeganisme van die kragtigste 5-jodoindool toegelig deur middel van mikroskopie, tydverloopfotografie en molekulêre docking-eksperimente, en die toksiese effekte daarvan op plante beoordeel deur 'n saadontkiemingstoets te gebruik.
Daar is voorheen berig dat hoë konsentrasies (>1.0 mM) indool 'n nematodesdodende effek op nematodes het17. Na behandeling van B. xylophilus (gemengde lewensfases) met indool of 33 verskillende indoolderivate teen 1 mM, is die mortaliteit van B. xylophilus gemeet deur lewende en dooie nematodes in die kontrole- en behandelde groepe te tel. Vyf indole het beduidende nematodesdodende aktiwiteit getoon; die oorlewing van die onbehandelde kontrolegroep was 95 ± 7% na 24 uur. Van die 34 indole wat getoets is, het 5-jodoindool en 4-fluoroindool teen 1 mM 100% mortaliteit veroorsaak, terwyl 5,6-difluorindigo, metilindol-7-karboksilaat en 7-jodoindool ongeveer 50% mortaliteit veroorsaak het (Tabel 1).
Effek van 5-jodoindool op vakuolvorming en metabolisme van dennehoutnematode. (A) Effek van avermektien en 5-jodoindool op volwasse manlike nematodes, (B) L1-stadium nematode-eiers en (C) metabolisme van B. xylophilus, (i) vakuole is nie waargeneem na 0 uur nie, behandeling het gelei tot (ii) vakuole, (iii) ophoping van veelvuldige vakuole, (iv) swelling van vakuole, (v) samesmelting van vakuole en (vi) vorming van reuse-vakuole. Rooi pyle dui swelling van vakuole aan, blou pyle dui samesmelting van vakuole aan en swart pyle dui reuse-vakuole aan. Skaalbalk = 50 μm.
Daarbenewens het hierdie studie ook die opeenvolgende proses van metaan-geïnduseerde dood in dennenematodes beskryf (Figuur 4C). Metanogene dood is 'n nie-apoptotiese tipe seldood wat verband hou met die ophoping van prominente sitoplasmiese vakuole27. Die morfologiese defekte wat in dennenematodes waargeneem word, blyk nou verwant te wees aan die meganisme van metaan-geïnduseerde dood. Mikroskopiese ondersoek op verskillende tye het getoon dat reuse-vakuole gevorm is na 20 uur se blootstelling aan 5-jodoindool (0.1 mM). Mikroskopiese vakuole is na 8 uur se behandeling waargeneem, en hul aantal het na 12 uur toegeneem. Verskeie groot vakuole is na 14 uur waargeneem. Verskeie saamgesmelte vakuole was duidelik sigbaar na 12-16 uur se behandeling, wat aandui dat vakuolfusie die basis is van die metanogene doodsmeganisme. Na 20 uur is verskeie reuse-vakuole dwarsdeur die wurm gevind. Hierdie waarnemings verteenwoordig die eerste verslag van metuose in C. elegans.
In wurms wat met 5-jodoindool behandel is, is vakuool-aggregasie en -ruptuur ook waargeneem (Fig. 5), soos blyk uit wurmbuiging en vakuoolvrystelling in die omgewing. Vakuool-ontwrigting is ook waargeneem in die eierdopmembraan, wat normaalweg deur L2 tydens uitbroei ongeskonde bewaar word (Aanvullende Fig. S2). Hierdie waarnemings ondersteun die betrokkenheid van vloeistofakkumulasie en osmoregulerende mislukking, sowel as omkeerbare selskade (RCI), in die proses van vakuoolvorming en ettering (Fig. 5).
Deur die rol van jodium in die waargenome vakuolvorming te hipotetiseer, het ons die nematode-dodende aktiwiteit van natriumjodied (NaI) en kaliumjodied (KI) ondersoek. By konsentrasies (0.1, 0.5 of 1 mM) het hulle egter nie die oorlewing van nematodes of vakuolvorming beïnvloed nie (Aanvullende Fig. S5), alhoewel 1 mM KI 'n effense nematode-dodende effek gehad het. Aan die ander kant het 7-jodoindool (1 of 2 mM), soos 5-jodoindool, veelvuldige vakuole en strukturele vervormings veroorsaak (Aanvullende Fig. S6). Die twee jodoindole het soortgelyke fenotipiese eienskappe in dennenematodes getoon, terwyl NaI en KI dit nie gedoen het nie. Interessant genoeg het indool nie vakuolvorming in B. xylophilus by die getoetste konsentrasies veroorsaak nie (data nie getoon nie). Dus het die resultate bevestig dat die indool-jodiumkompleks verantwoordelik is vir die vakuolisering en metabolisme van B. xylophilus.
Onder die indole wat vir nematodisidale aktiwiteit getoets is, het 5-jodoindool die hoogste glipindeks van -5.89 kcal/mol gehad, gevolg deur 7-jodoindool (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindool (-4.33), en indool (-4.03) (Figuur 6). Die sterk ruggraatwaterstofbinding van 5-jodoindool aan leusien 218 stabiliseer die binding daarvan, terwyl alle ander indoolderivate aan serien 260 bind via sykettingwaterstofbindings. Onder ander gemodelleerde jodoindole het 2-jodoindool 'n bindingswaarde van -5.248 kcal/mol, wat te wyte is aan sy hoofwaterstofbinding met leusien 218. Ander bekende bindings sluit in 3-jodoindool (-4.3 kcal/mol), 4-jodoindool (-4.0 kcal/mol) en 6-fluoroindool (-2.6 kcal/mol) (Aanvullende Figuur S8). Die meeste gehalogeneerde indole en indool self, met die uitsondering van 5-jodoindool en 2-jodoindool, vorm 'n binding met serien 260. Die feit dat waterstofbinding met leusien 218 dui op doeltreffende reseptor-ligandbinding, soos waargeneem vir ivermektien (Aanvullende Fig. S7), bevestig dat 5-jodoindool en 2-jodoindool, soos ivermektien, styf aan die aktiewe plek van die GluCL-reseptor bind via leusien 218 (Fig. 6 en Aanvullende Fig. S8). Ons stel voor dat hierdie binding nodig is om die oop poriestruktuur van die GluCL-kompleks te handhaaf en dat deur styf aan die aktiewe plek van die GluCL-reseptor te bind, 5-jodoindool, 2-jodoindool, avermektien en ivermektien dus die ioonkanaal oop hou en vloeistofopname toelaat.
Molekulêre koppeling van indool en gehalogeneerde indool aan GluCL. Bindingsoriëntasies van (A) indool, (B) 4-fluoroindool, (C) 7-jodoindool, en (D) 5-jodoindoolligande aan die aktiewe plek van GluCL. Die proteïen word deur 'n lint voorgestel, en die ruggraatwaterstofbindings word as geel stippellyne getoon. (A′), (B′), (C′) en (D′) toon die interaksies van die ooreenstemmende ligande met die omliggende aminosuurresidue, en die sykettingwaterstofbindings word aangedui deur pienk stippelpyle.
Eksperimente is uitgevoer om die toksiese effek van 5-jodoindool op die ontkieming van kool- en radysaad te evalueer. 5-jodoindool (0.05 of 0.1 mM) of avermektien (10 μg/mL) het min of geen effek op die aanvanklike ontkieming en plantjie-opkoms gehad nie (Figuur 7). Daarbenewens is geen beduidende verskil gevind tussen die ontkiemingstempo van onbehandelde kontroles en sade wat met 5-jodoindool of avermektien behandel is nie. Die effek op penwortelverlenging en die aantal laterale wortels wat gevorm is, was onbeduidend, alhoewel 1 mM (10 keer die aktiewe konsentrasie) van 5-jodoindool die ontwikkeling van laterale wortels effens vertraag het. Hierdie resultate dui daarop dat 5-jodoindool nie-giftig is vir plantselle en nie inmeng met plantontwikkelingsprosesse by die bestudeerde konsentrasies nie.
Effek van 5-jodoindool op saadontkieming. Ontkieming, spruitvorming en laterale beworteling van B. oleracea- en R. raphanistrum-sade op Murashige- en Skoog-agarmedium met of sonder avermektien of 5-jodoindool. Ontkieming is aangeteken na 3 dae van inkubasie by 22°C.
Hierdie studie rapporteer verskeie gevalle van nematode-doodmaak deur indole. Dit is belangrik om te weet dat dit die eerste verslag is van jodoindool wat metilering veroorsaak (’n proses wat veroorsaak word deur die ophoping van klein vakuole wat geleidelik in reuse-vakuole saamsmelt, wat uiteindelik lei tot membraanbreuk en dood) in dennenaalde, met jodoindool wat beduidende nematodedodende eienskappe vertoon soortgelyk aan dié van die kommersiële nematode-dodende middel avermektien.
Daar is voorheen berig dat indole verskeie seinfunksies in prokariote en eukariote uitoefen, insluitend biofilm-inhibisie/vorming, bakteriële oorlewing en patogenisiteit19,32,33,34. Onlangs het die potensiële terapeutiese effekte van gehalogeneerde indole, indoolalkaloïede en semisintetiese indoolderivate uitgebreide navorsingsbelangstelling getrek35,36,37. Byvoorbeeld, gehalogeneerde indole is getoon om aanhoudende Escherichia coli- en Staphylococcus aureus-selle te dood37. Daarbenewens is dit van wetenskaplike belang om die doeltreffendheid van gehalogeneerde indole teen ander spesies, genera en koninkryke te bestudeer, en hierdie studie is 'n stap in die rigting van die bereiking van hierdie doelwit.
Hier stel ons 'n meganisme voor vir 5-jodoindool-geïnduseerde letaliteit in C. elegans gebaseer op omkeerbare selbesering (RCI) en metilering (Figure 4C en 5). Edematiese veranderinge soos opgeblasenheid en vakuolêre degenerasie is aanduiders van RCI en metilering, wat gemanifesteer word as reuse-vakuole in die sitoplasma48,49. RCI belemmer energieproduksie deur ATP-produksie te verminder, wat die ATPase-pomp laat misluk, of selmembrane te ontwrig en 'n vinnige invloei van Na+, Ca2+ en water50,51,52 te veroorsaak. Intrasitoplasmiese vakuole ontstaan in dierselle as gevolg van vloeistofophoping in die sitoplasma as gevolg van die invloei van Ca2+ en water53. Interessant genoeg is hierdie meganisme van selskade omkeerbaar as die skade tydelik is en die selle vir 'n sekere tydperk ATP begin produseer, maar as die skade voortduur of vererger, sterf die selle.54 Ons waarnemings toon dat nematodes wat met 5-jodoindool behandel is, nie in staat is om normale biosintese te herstel na blootstelling aan strestoestande nie.
Die metileringsfenotipe wat deur 5-jodoindool in B. xylophilus geïnduseer word, kan te wyte wees aan die teenwoordigheid van jodium en die molekulêre verspreiding daarvan, aangesien 7-jodoindool minder inhiberende effek op B. xylophilus gehad het as 5-jodoindool (Tabel 1 en Aanvullende Figuur S6). Hierdie resultate stem gedeeltelik ooreen met die studies van Maltese et al. (2014), wat berig het dat die translokasie van die piridielstikstofdeel in indool van die para- na die meta-posisie vakuolisering, groeiinhibisie en sitotoksisiteit in U251-selle afgeskaf het, wat daarop dui dat die interaksie van die molekule met 'n spesifieke aktiewe plek in die proteïen krities is27,44,45. Die interaksies tussen indool- of gehalogeneerde indole en GluCL-reseptore wat in hierdie studie waargeneem is, ondersteun ook hierdie idee, aangesien gevind is dat 5- en 2-jodoindool sterker aan GluCL-reseptore bind as die ander indole wat ondersoek is (Figuur 6 en Aanvullende Figuur S8). Daar is gevind dat die jodium by die tweede of vyfde posisie van die indool aan leusien 218 van die GluCL-reseptor bind via ruggraatwaterstofbindings, terwyl ander gehalogeneerde indole en indool self swak sykettingwaterstofbindings met serien 260 vorm (Figuur 6). Ons spekuleer dus dat die lokalisering van die halogeen 'n belangrike rol speel in die induksie van vakuolêre degenerasie, terwyl die stywe binding van 5-jodoindool die ioonkanaal oop hou, waardeur vinnige vloeistofinvloei en vakuolbreuk moontlik word. Die gedetailleerde werkingsmeganisme van 5-jodoindool moet egter nog bepaal word.
Voor die praktiese toepassing van 5-jodoindool moet die toksiese effek daarvan op plante geanaliseer word. Ons saadontkiemingseksperimente het getoon dat 5-jodoindool geen negatiewe effek op saadontkieming of daaropvolgende ontwikkelingsprosesse gehad het teen die bestudeerde konsentrasies nie (Figuur 7). Dus bied hierdie studie 'n basis vir die gebruik van 5-jodoindool in die ekologiese omgewing om die skadelikheid van dennenematode vir dennebome te beheer.
Vorige verslae het getoon dat indool-gebaseerde terapie 'n potensiële benadering verteenwoordig om die probleem van antibiotika-weerstandigheid en kankerprogressie aan te spreek55. Daarbenewens beskik indole oor antibakteriese, antikanker-, antioksidant-, anti-inflammatoriese, antidiabetiese, antivirale, antiproliferatiewe en antituberkulose-aktiwiteite en kan dit dien as 'n belowende basis vir geneesmiddelontwikkeling56,57. Hierdie studie dui vir die eerste keer op die potensiële gebruik van jodium as 'n antiparasitiese en anthelmintiese middel.
Avermektien is drie dekades gelede ontdek en het die Nobelprys in 2015 gewen, en die gebruik daarvan as 'n anthelmintikum is steeds aktief aan die gang. As gevolg van die vinnige ontwikkeling van weerstand teen avermektiene in nematodes en insekplae, is 'n alternatiewe, laekoste- en omgewingsvriendelike strategie egter nodig om denneboominfeksie in dennebome te beheer. Hierdie studie rapporteer ook die meganisme waardeur 5-jodoindool dennenematodes doodmaak en dat 5-jodoindool lae toksisiteit vir plantselle het, wat goeie vooruitsigte vir die toekomstige kommersiële toepassing daarvan bied.
Alle eksperimente is goedgekeur deur die Etiekkomitee van Yeungnam Universiteit, Gyeongsan, Korea, en die metodes is uitgevoer in ooreenstemming met die riglyne van die Etiekkomitee van Yeungnam Universiteit.
Eierinkubasie-eksperimente is uitgevoer met behulp van gevestigde prosedures43. Om uitbroeisyfers (HR) te bepaal, is 1-dag oue volwasse nematodes (ongeveer 100 wyfies en 100 mannetjies) oorgeplaas na Petri-bakkies wat die swam bevat en toegelaat om vir 24 uur te groei. Eiers is toe geïsoleer en behandel met 5-jodoindool (0.05 mM en 0.1 mM) of avermektien (10 μg/ml) as 'n suspensie in steriele gedistilleerde water. Hierdie suspensies (500 μl; ongeveer 100 eiers) is oorgeplaas na die putjies van 'n 24-putjie weefselkweekplaat en geïnkubeer by 22 °C. L2-tellings is gemaak na 24 uur inkubasie, maar is as dood beskou as die selle nie beweeg het toe dit met 'n fyn platinumdraad gestimuleer is nie. Hierdie eksperiment is in twee fases uitgevoer, elk met ses herhalings. Die data van beide eksperimente is gekombineer en aangebied. Die persentasie HR word soos volg bereken:
Larwale mortaliteit is bepaal deur gebruik te maak van voorheen ontwikkelde prosedures. Nematode-eiers is versamel en embrio's is gesinchroniseer deur uitbroei in steriele gedistilleerde water om L2-stadium larwes te genereer. Gesinchroniseerde larwes (ongeveer 500 nematodes) is behandel met 5-jodoindool (0.05 mM en 0.1 mM) of avermektien (10 μg/ml) en grootgemaak op B. cinerea Petri-plate. Na 48 uur inkubasie by 22 °C is nematodes in steriele gedistilleerde water versamel en ondersoek vir die teenwoordigheid van L2-, L3- en L4-stadiums. Die teenwoordigheid van L3- en L4-stadiums het larwale transformasie aangedui, terwyl die teenwoordigheid van die L2-stadium geen transformasie aangedui het nie. Beelde is verkry met behulp van die iRiS™ Digital Cell Imaging System. Hierdie eksperiment is in twee stadiums uitgevoer, elk met ses herhalings. Die data van beide eksperimente is gekombineer en aangebied.
Die toksisiteit van 5-jodoindool en avermektien vir sade is bepaal deur middel van ontkiemingstoetse op Murashige- en Skoog-agarplate.62 B. oleracea- en R. raphanistrum-sade is eers vir een dag in steriele gedistilleerde water geweek, gewas met 1 ml 100% etanol, gesteriliseer met 1 ml 50% kommersiële bleikmiddel (3% natriumhipochloriet) vir 15 minute, en vyf keer gewas met 1 ml steriele water. Die gesteriliseerde sade is toe op ontkiemingsagarplate gedruk wat 0.86 g/l (0.2X) Murashige- en Skoog-medium en 0.7% bakteriologiese agar met of sonder 5-jodoindool of avermektien bevat. Die plate is toe by 22 °C geïnkubeer, en beelde is na 3 dae van inkubasie geneem. Hierdie eksperiment is in twee fases uitgevoer, elk met ses herhalings.
Plasingstyd: 26 Februarie 2025