Die denneaalwurm is 'n kwarantyn-migrerende endoparasiet wat bekend is dat dit ernstige ekonomiese verliese in dennebos-ekosisteme veroorsaak. Die huidige studie bespreek die aalwurmdodende aktiwiteit van gehalogeneerde indole teen denneaalwurms en hul werkingsmeganisme. Die aalwurmdodende aktiwiteite van 5-jodoindool en avermektien (positiewe beheer) teen denneaalwurms was soortgelyk en hoog by lae konsentrasies (10 μg/mL). 5-joodindool verminder vrugbaarheid, reproduktiewe aktiwiteit, embrioniese en larwale mortaliteit, en bewegingsgedrag. Molekulêre interaksies van ligande met invertebraat-spesifieke glutamaat-omheinde chloriedkanaalreseptore ondersteun die idee dat 5-jodoindool, soos avermektien, styf aan die reseptor aktiewe plek bind. 5-Jodoindool het ook verskeie fenotipiese vervormings in nematodes geïnduseer, insluitend abnormale orgaan-ineenstorting/krimping en verhoogde vakuolisering. Hierdie resultate dui daarop dat vakuole 'n rol kan speel in nematode-metilering-gemedieerde dood. Dit is belangrik dat 5-jodoindool nie-giftig was vir beide plantspesies (kool en radyse). Dus, hierdie studie demonstreer dat joodindool toediening onder omgewingstoestande denneverwelkbesering kan beheer.
Dennehoutaalwurm (Bursaphelenchus xylophilus) behoort aan die dennehoutaalwurms (PWN), migrerende endoparasitiese nematodes wat bekend is om ernstige ekologiese skade aan dennebos-ekosisteme te veroorsaak1. Denneverwelksiekte (PWD) wat deur die dennehoutaalwurm veroorsaak word, word 'n ernstige probleem op verskeie vastelande, insluitend Asië en Europa, en in Noord-Amerika vernietig die nematode ingevoerde dennespesies1,2. Afname van dennebome is 'n groot ekonomiese probleem, en die vooruitsig van die wêreldwye verspreiding daarvan is kommerwekkend3. Die volgende dennespesies word die meeste deur die nematode aangeval: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii en Pinus radiata4. Denneaalwurm is 'n ernstige siekte wat dennebome binne weke of maande van infeksie kan doodmaak. Boonop is denneaalwurm-uitbrake algemeen in 'n verskeidenheid ekosisteme, so aanhoudende infeksiekettings is gevestig1.
Bursaphelenchus xylophilus is 'n kwarantynplant-parasitiese aalwurm wat aan die superfamilie Aphelenchoidea en klade 102.5 behoort. Die aalwurm voed op swamme en reproduseer in die houtweefsels van dennebome en ontwikkel in vier verskillende larwestadia: L1, L2, L3, L4 en 'n volwasse individu1,6. Onder toestande van voedseltekort gaan die denneaalwurm oor in 'n gespesialiseerde larfstadium – dauer, wat sy vektor parasiteer – die dennebaskewer (Monochamus alternatus) en word na gesonde dennebome oorgeplaas. By gesonde gashere migreer aalwurms vinnig deur plantweefsels en voed op parenchimatiese selle, wat lei tot 'n aantal hipersensitiwiteitsreaksies, denneverwelking en dood binne 'n jaar na infeksie1,7,8.
Biologiese beheer van denneaalwurms is lank reeds 'n uitdaging, met kwarantynmaatreëls wat terugdateer na die 20ste eeu. Huidige strategieë vir die beheer van denneaalwurms behels hoofsaaklik chemiese behandelings, insluitend houtberoking en inplanting van aalwurmdoders in boomstamme. Die mees gebruikte aalwurmdoders is avermektien en avermektienbensoaat, wat aan die avermektienfamilie behoort. Hierdie duur chemikalieë is hoogs doeltreffend teen baie aalwurmspesies en word as omgewingsveilig beskou9. Daar word egter verwag dat herhaalde gebruik van hierdie aalwurmdoders seleksiedruk sal veroorsaak wat byna seker sal lei tot die opkoms van weerstandbiedende denneaalwurms, soos gedemonstreer is vir verskeie insekplae, soos Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella en die nematodes Trichostrongylus colubriformis en Ostertagia circus, wat ontwikkel het teen graducinacta circa weerstand. avermektiene10,11,12. Daarom moet weerstandspatrone gereeld bestudeer word en aalwurmdoders voortdurend gekeur word om alternatiewe, koste-effektiewe en omgewingsvriendelike maatreëls te vind om PVD te beheer. In die afgelope dekades het 'n aantal skrywers die gebruik van plantekstrakte, essensiële olies en vlugtige stowwe as aalwurmbeheermiddels voorgestel13,14,15,16.
Ons het onlangs die aalwurmdodende aktiwiteit van indool, 'n intersellulêre en interkoninkryk seinmolekule, in Caenorhabditis elegans 17 gedemonstreer. Indool is 'n wydverspreide intrasellulêre sein in mikrobiese ekologie, wat talle funksies beheer wat mikrobiese fisiologie, spoorvorming, plasmiedstabiliteit, geneesmiddelweerstand, biofilmvorming en virulensie beïnvloed 18, 19 . Die aktiwiteit van indool en sy derivate teen ander patogene nematodes is nie bestudeer nie. In hierdie studie het ons die aalwurmdodende aktiwiteit van 34 indole teen denneaalwurms ondersoek en die werkingsmeganisme van die mees kragtige 5-jodoindool toegelig deur mikroskopie, tydsverloopfotografie en molekulêre dok-eksperimente, en die toksiese effekte daarvan op plante met behulp van 'n saadontkiemingstoets beoordeel.
Hoë konsentrasies (>1.0 mM) indool is voorheen aangemeld om 'n aalwurmdodende effek op aalwurms te hê17. Na behandeling van B. xylophilus (gemengde lewensfases) met indool of 33 verskillende indoolderivate teen 1 mM, is mortaliteit van B. xylophilus gemeet deur lewende en dooie nematodes in die kontrole en behandelde groepe te tel. Vyf indole het beduidende aalwurmdodende aktiwiteit getoon; die oorlewing van die onbehandelde kontrolegroep was 95 ± 7% na 24 uur. Van die 34 indole wat getoets is, het 5-jodoindool en 4-fluoroindool by 1 mM 100% mortaliteit veroorsaak, terwyl 5,6-difluoroindigo, metielindool-7-karboksilaat en 7-jodoindool ongeveer 50% mortaliteit veroorsaak het (Tabel 1).
Effek van 5-joodindool op vakuoolvorming en metabolisme van dennehoutaalwurm. (A) Effek van avermektien en 5-jodoindool op volwasse manlike nematodes, (B) L1 stadium nematode eiers en (C) metabolisme van B. xylophilus, (i) vakuole is nie op 0 uur waargeneem nie, behandeling het gelei tot (ii) vakuole, (iii) ophoping van veelvuldige vakuole, (iv) fusie van vacuole, (iv) fusion of vacuoles vakuole en (vi) vorming van reuse-vakuole. Rooi pyle dui op swelling van vakuole, blou pyle dui samesmelting van vakuole aan en swart pyle dui reuse-vakuole aan. Skaalstaaf = 50 μm.
Daarbenewens het hierdie studie ook die opeenvolgende proses van metaan-geïnduseerde dood in denneaalwurms beskryf (Figuur 4C). Metanogeniese dood is 'n nie-apoptotiese tipe seldood wat geassosieer word met die ophoping van prominente sitoplasmiese vakuole27. Die morfologiese defekte wat in denneaalwurms waargeneem is blyk nou verwant te wees aan die meganisme van metaan-geïnduseerde dood. Mikroskopiese ondersoek op verskillende tye het getoon dat reuse-vakuole gevorm is na 20 uur se blootstelling aan 5-jodoindool (0.1 mM). Mikroskopiese vakuole is na 8 uur se behandeling waargeneem, en hul getal het na 12 uur toegeneem. Verskeie groot vakuole is na 14 uur waargeneem. Verskeie saamgesmelte vakuole was duidelik sigbaar na 12-16 uur se behandeling, wat aandui dat vakuoolsamesmelting die basis van die metanogene doodsmeganisme is. Na 20 uur is verskeie reuse-vakuole regdeur die wurm gevind. Hierdie waarnemings verteenwoordig die eerste verslag van metuose in C. elegans.
By 5-jodoindool-behandelde wurms is vakuoolaggregasie en -breuk ook waargeneem (Fig. 5), soos blyk uit wurmbuiging en vakuoolvrystelling in die omgewing. Vakuoolontwrigting is ook waargeneem in die eierdopmembraan, wat normaalweg ongeskonde deur L2 bewaar word tydens uitbroei (Aanvullende Fig. S2). Hierdie waarnemings ondersteun die betrokkenheid van vloeistofophoping en osmoregulerende mislukking, sowel as omkeerbare selbesering (RCI), in die proses van vakuoolvorming en suppurasie (Fig. 5).
Met die hipotese van die rol van jodium in die waargenome vakuoolvorming, het ons die aalwurmdodende aktiwiteit van natriumjodied (NaI) en kaliumjodied (KI) ondersoek. By konsentrasies (0.1, 0.5 of 1 mM), het dit egter nie óf nematode-oorlewing óf vakuoolvorming beïnvloed nie (Aanvullende Fig. S5), alhoewel 1 mM KI 'n effense aalwurmdodende effek gehad het. Aan die ander kant het 7-jodoindool (1 of 2 mM), soos 5-jodoindool, veelvuldige vakuole en strukturele vervormings geïnduseer (Aanvullende Fig. S6). Die twee joodindole het soortgelyke fenotipiese eienskappe in denneaalwurms getoon, terwyl NaI en KI dit nie gedoen het nie. Interessant genoeg het indool nie vakuoolvorming in B. xylophilus geïnduseer by die konsentrasies wat getoets is nie (data nie getoon nie). Die resultate het dus bevestig dat die indool-jodiumkompleks verantwoordelik is vir die vakuolisering en metabolisme van B. xylophilus.
Onder die indole wat vir aalwurmdodende aktiwiteit getoets is, het 5-jodoindool die hoogste glipindeks van -5.89 kcal/mol gehad, gevolg deur 7-jodoindool (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindool (-4.33) en indool (-4.03) (Figuur 6). Die sterk ruggraatwaterstofbinding van 5-jodoindool aan leucine 218 stabiliseer die binding daarvan, terwyl alle ander indoolderivate via sykettingwaterstofbindings aan serien 260 bind. Onder ander gemodelleerde joodindole het 2-joodindool 'n bindingswaarde van -5,248 kcal/mol, wat te danke is aan sy hoofwaterstofbinding met leucine 218. Ander bekende bindings sluit in 3-joodindool (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindool (-4,0 kcal/mol.6-mol) en 6-2 kcal/mol. Figuur S8). Die meeste gehalogeneerde indole en indool self, met die uitsondering van 5-jood-indool en 2-jood-indool, vorm 'n binding met serien 260. Die feit dat waterstofbinding met leucine 218 'n aanduiding is van doeltreffende reseptor-ligand-binding, soos waargeneem vir ivermektien (Aanvullende Fig. S7), bevestig dat 5-iodo-indool soos 5-io-indool en 5-io-indool. ivermektien, bind styf aan die aktiewe plek van die GluCL-reseptor via leucine 218 (Fig. 6 en Aanvullende Fig. S8). Ons stel voor dat hierdie binding nodig is om die oop poriestruktuur van die GluCL-kompleks te handhaaf en dat deur styf te bind aan die aktiewe plek van die GluCL-reseptor, 5-jodoindool, 2-jodoindool, avermektien en ivermektien dus die ioonkanaal oop hou en vloeistofopname toelaat.
Molekulêre koppeling van indool en gehalogeneerde indool na GluCL. Binding van oriëntasies van (A) indool, (B) 4-fluoroindool, (C) 7-jodoindool, en (D) 5-jodoindool ligande aan die aktiewe plek van GluCL. Die proteïen word deur 'n lint voorgestel, en die waterstofbindings van die ruggraat word as geel stippellyne getoon. (A′), (B′), (C′), en (D′) toon die interaksies van die ooreenstemmende ligande met die omliggende aminosuurreste, en die sykettingwaterstofbindings word deur pienk stippelpyle aangedui.
Eksperimente is uitgevoer om die toksiese effek van 5-jodoindool op die ontkieming van kool en radyse sade te evalueer. 5-joodindool (0.05 of 0.1 mM) of avermektien (10 μg/ml) het min of geen effek op aanvanklike ontkieming en plantjie-opkoms gehad nie (Figuur 7). Daarbenewens is geen betekenisvolle verskil gevind tussen die ontkiemingstempo van onbehandelde kontroles en sade wat met 5-jodoindool of avermektien behandel is nie. Die effek op penwortelverlenging en die aantal sywortels wat gevorm word was onbeduidend, alhoewel 1 mM (10 keer sy aktiewe konsentrasie) 5-jodoindool die ontwikkeling van sywortels effens vertraag het. Hierdie resultate dui aan dat 5-jodoindool nie-toksies vir plantselle is en nie inmeng met plantontwikkelingsprosesse by die konsentrasies wat bestudeer is nie.
Effek van 5-jodoindool op saadontkieming. Ontkieming, ontkieming en laterale wortels van B. oleracea en R. raphanistrum sade op Murashige en Skoog agar medium met of sonder avermektien of 5-jodoindool. Ontkieming is aangeteken na 3 dae van inkubasie by 22°C.
Hierdie studie meld verskeie gevalle van aalwurm dood deur indole. Dit is belangrik dat dit die eerste verslag is van jodindool-induserende metilering ('n proses wat veroorsaak word deur die ophoping van klein vakuole wat geleidelik saamsmelt in reuse-vakuole, wat uiteindelik lei tot membraanbreuk en dood) in dennenaalde, met jodindool wat beduidende aalwurmdodende eienskappe vertoon soortgelyk aan dié van die kommersiële aalwurmdoder-aweredoder.
Indole is voorheen gerapporteer om verskeie seinfunksies in prokariote en eukariote uit te oefen, insluitend biofilm inhibisie/vorming, bakteriese oorlewing en patogenisiteit19,32,33,34. Onlangs het die potensiële terapeutiese effekte van gehalogeneerde indole, indoolalkaloïede en semisintetiese indoolderivate uitgebreide navorsingsbelangstelling gelok35,36,37. Daar is byvoorbeeld getoon dat gehalogeneerde indole aanhoudende Escherichia coli- en Staphylococcus aureus-selle doodmaak37. Daarbenewens is dit van wetenskaplike belang om die doeltreffendheid van gehalogeneerde indole teen ander spesies, genera en koninkryke te bestudeer, en hierdie studie is 'n stap in die rigting van die bereiking van hierdie doelwit.
Hier stel ons 'n meganisme voor vir 5-jodoindool-geïnduseerde dodelikheid in C. elegans gebaseer op omkeerbare selbesering (RCI) en metilering (Figure 4C en 5). Oedematiese veranderinge soos opgeblase en vakuolêre degenerasie is aanwysers van RCI en metilering, wat as reuse-vakuole in die sitoplasma gemanifesteer word48,49. RCI meng in met energieproduksie deur ATP-produksie te verminder, wat mislukking van die ATPase-pomp veroorsaak, of selmembrane te ontwrig en 'n vinnige invloei van Na+, Ca2+ en water te veroorsaak50,51,52. Intrasitoplasmiese vakuole ontstaan in dierselle as gevolg van vloeistofophoping in die sitoplasma as gevolg van die invloei van Ca2+ en water53. Interessant genoeg is hierdie meganisme van selskade omkeerbaar as die skade tydelik is en die selle begin om ATP vir 'n sekere tydperk te produseer, maar as die skade voortduur of vererger, sterf die selle.54 Ons waarnemings toon dat aalwurms wat met 5-jodoindool behandel is nie in staat is om normale biosintese te herstel na blootstelling aan strestoestande nie.
Die metileringsfenotipe wat deur 5-jodoindool in B. xylophilus geïnduseer word, kan te wyte wees aan die teenwoordigheid van jodium en sy molekulêre verspreiding, aangesien 7-jodoindool minder inhiberende effek op B. xylophilus gehad het as 5-jodoindool (Tabel 1 en Aanvullende Figuur S6). Hierdie resultate stem gedeeltelik ooreen met die studies van Maltese et al. (2014), wat gerapporteer het dat translokasie van die piridielstikstofdeel in indool van die para- na die meta-posisie vakuolisering, groei-inhibisie en sitotoksisiteit in U251-selle opgehef het, wat daarop dui dat die interaksie van die molekule met 'n spesifieke aktiewe plek in die proteïen krities is27,44,45. Die interaksies tussen indool of gehalogeneerde indole en GluCL reseptore waargeneem in hierdie studie ondersteun ook hierdie idee, aangesien gevind is dat 5- en 2-jodoindool sterker aan GluCL reseptore bind as die ander indole wat ondersoek is (Figuur 6 en Aanvullende Figuur S8). Daar is gevind dat die jodium by die tweede of vyfde posisie van die indool aan leucine 218 van die GluCL-reseptor bind via ruggraatwaterstofbindings, terwyl ander gehalogeneerde indole en indool self swak sykettingwaterstofbindings met serien 260 vorm (Figuur 6). Ons spekuleer dus dat die lokalisering van die halogeen 'n belangrike rol speel in die induksie van vakuolêre degenerasie, terwyl die stywe binding van 5-jodoindool die ioonkanaal oop hou, en sodoende vinnige vloeistofinvloei en vakuoolbreuk toelaat. Die gedetailleerde werkingsmeganisme van 5-jodoindool moet egter nog bepaal word.
Voor praktiese toepassing van 5-jodoindool moet die toksiese effek daarvan op plante ontleed word. Ons saadontkiemingseksperimente het getoon dat 5-jodoindool geen negatiewe effek op saadontkieming of daaropvolgende ontwikkelingsprosesse gehad het by die konsentrasies wat bestudeer is nie (Figuur 7). Hierdie studie verskaf dus 'n basis vir die gebruik van 5-jodoindool in die ekologiese omgewing om die skadelikheid van denneaalwurms vir dennebome te beheer.
Vorige verslae het getoon dat indool-gebaseerde terapie 'n potensiële benadering verteenwoordig om die probleem van antibiotika weerstand en kanker vordering aan te spreek55. Boonop besit indole antibakteriese, antikanker-, antioksidant-, anti-inflammatoriese, antidiabetiese, antivirale, antiproliferatiewe en antituberkulose-aktiwiteite en kan dit as 'n belowende basis vir geneesmiddelontwikkeling dien56,57. Hierdie studie stel vir die eerste keer die potensiële gebruik van jodium as 'n antiparasitiese en anthelmintiese middel voor.
Avermektien is drie dekades gelede ontdek en het die Nobelprys in 2015 gewen, en die gebruik daarvan as 'n wurmmiddel is steeds aktief aan die gang. As gevolg van die vinnige ontwikkeling van weerstand teen avermektiene in aalwurms en insekplae, is 'n alternatiewe, laekoste- en omgewingsvriendelike strategie egter nodig om PWN-infeksie in dennebome te beheer. Hierdie studie rapporteer ook die meganisme waardeur 5-jodoindool denneaalwurms doodmaak en dat 5-jodoindool lae toksisiteit vir plantselle het, wat goeie vooruitsigte vir die toekomstige kommersiële toepassing daarvan bied.
Alle eksperimente is goedgekeur deur die Etiekkomitee van Yeungnam Universiteit, Gyeongsan, Korea, en die metodes is uitgevoer in ooreenstemming met die riglyne van die Etiekkomitee van Yeungnam Universiteit.
Eier-inkubasie-eksperimente is uitgevoer met behulp van gevestigde prosedures43. Om uitbroeitempo (HR) te bepaal, is 1-dag-oue volwasse nematodes (ongeveer 100 wyfies en 100 mannetjies) oorgeplaas na Petri-skottels wat die swam bevat en toegelaat om vir 24 uur te groei. Eiers is dan geïsoleer en behandel met 5-joodindool (0.05 mM en 0.1 mM) of avermektien (10 μg/ml) as 'n suspensie in steriele gedistilleerde water. Hierdie suspensies (500 μl; ongeveer 100 eiers) is na die putte van 'n 24-put weefselkultuurplaat oorgeplaas en by 22 °C geïnkubeer. L2-tellings is gemaak na 24 uur se inkubasie, maar is as dood beskou as die selle nie beweeg wanneer dit met 'n fyn platinumdraad gestimuleer word nie. Hierdie eksperiment is in twee fases uitgevoer, elk met ses herhalings. Die data van beide eksperimente is gekombineer en aangebied. Die persentasie HR word soos volg bereken:
Larwale mortaliteit is geassesseer met behulp van voorheen ontwikkelde prosedures. Aalwurm eiers is versamel en embrio's is gesinchroniseer deur uitbroei in steriele gedistilleerde water om L2 stadium larwes te genereer. Gesinchroniseerde larwes (ongeveer 500 nematodes) is met 5-jodoindool (0.05 mM en 0.1 mM) of avermektien (10 μg/ml) behandel en op B. cinerea Petri plate grootgemaak. Na 48 uur se inkubasie by 22 °C, is aalwurms in steriele gedistilleerde water versamel en ondersoek vir die teenwoordigheid van L2, L3 en L4 stadiums. Die teenwoordigheid van L3 en L4 stadiums het larwale transformasie aangedui, terwyl die teenwoordigheid van die L2 stadium geen transformasie aangedui het nie. Beelde is verkry met behulp van die iRiS™ Digital Cell Imaging System. Hierdie eksperiment is in twee fases uitgevoer, elk met ses herhalings. Die data van beide eksperimente is gekombineer en aangebied.
Die toksisiteit van 5-joodindool en avermektien vir sade is geassesseer met behulp van ontkiemingstoetse op Murashige- en Skoog-agarplate.62 B. oleracea- en R. raphanistrum-sade is eers vir een dag in steriele gedistilleerde water geweek, gewas met 1 ml 100% vir kommersiële etanol, gesteriliseer met 50% 1 ml etanol, gesteriliseer met 50% etanol. 15 min, en was vyf keer met 1 ml steriele water. Die gesteriliseerde sade is dan op ontkiemingsagarplate gedruk wat 0.86 g/l (0.2X) Murashige en Skoog medium en 0.7% bakteriologiese agar met of sonder 5-jodoindool of avermektien bevat het. Die plate is dan by 22 °C geïnkubeer, en beelde is geneem na 3 dae van inkubasie. Hierdie eksperiment is in twee fases uitgevoer, wat elk ses herhalings gehad het.
Postyd: 26 Februarie 2025