Loot apikale meristeem (SAM) groei is van kritieke belang vir stamargitektuur. Planthormonegibberelliene(GA's) speel sleutelrolle in die koördinering van plantegroei, maar hul rol in die SAM word steeds swak verstaan. Hier het ons 'n ratiometriese biosensor van GA-sein ontwikkel deur die DELLA-proteïen te ontwerp om die noodsaaklike regulatoriese funksie daarvan in die GA-transkripsierespons te onderdruk, terwyl die agteruitgang daarvan by GA-herkenning bewaar word. Ons demonstreer dat hierdie degradasie-gebaseerde biosensor veranderinge in GA-vlakke en sellulêre waarneming tydens ontwikkeling akkuraat aanteken. Ons het hierdie biosensor gebruik om GA-seinaktiwiteit in die SAM te karteer. Ons toon dat hoë GA-seine hoofsaaklik teenwoordig is in selle geleë tussen orgaan primordia, wat voorlopers van internodeselle is. Deur gebruik te maak van wins- en verlies-van-funksie-benaderings, demonstreer ons verder dat GA die oriëntasie van die seldelingsvlak reguleer, wat die kanoniese sellulêre organisasie van internodes vestig, en sodoende internode-spesifikasie in die SAM bevorder.
Die loot apikale meristeem (SAM), geleë by die loot toppunt, bevat 'n nis van stamselle waarvan die aktiwiteit laterale organe en stamknope op 'n modulêre en iteratiewe wyse deur die lewe van die plant genereer. Elkeen van hierdie herhalende eenhede, of plantnodusse, sluit internodes en laterale organe by die nodusse in, en okselvormige meristeme in die blaaroksels1. Die groei en organisasie van plantnodusse verander tydens ontwikkeling. In Arabidopsis word internodale groei tydens die vegetatiewe stadium onderdruk, en okselvormige meristeme bly dormant in die oksels van rosetblare. Tydens die oorgang na die blomfase word die SAM die bloeiwyse meristeem, wat verlengde internodes en okselknoppe, takke in die oksels van blomblare, en later, blaarlose blomme genereer2. Alhoewel ons aansienlike vordering gemaak het in die begrip van die meganismes wat die aanvang van blare, blomme en takke beheer, is relatief min bekend oor hoe internodes ontstaan.
Om die tydruimtelike verspreiding van GA's te verstaan, sal help om die funksies van hierdie hormone in verskillende weefsels en in verskillende ontwikkelingstadia beter te verstaan. Visualisering van die degradasie van RGA-GFP-fusie uitgedruk onder die aksie van sy eie promotor verskaf belangrike inligting oor die regulering van totale GA-vlakke in wortels15,16. RGA-uitdrukking wissel egter oor weefsels17 en word deur GA18 gereguleer. Differensiële uitdrukking van die RGA-promotor kan dus lei tot die fluoressensiepatroon wat met RGA-GFP waargeneem word en dus is hierdie metode nie kwantitatief nie. Meer onlangs het bioaktiewe fluoresceïen (Fl)-gemerkte GA19,20 die ophoping van GA in die wortelendokorteks en die regulering van sy sellulêre vlakke deur GA-vervoer geopenbaar. Onlangs het die GA FRET-sensor nlsGPS1 getoon dat GA-vlakke korreleer met selverlenging in wortels, filamente en donkergegroeide hipokotiele21. Soos ons egter gesien het, is GA-konsentrasie nie die enigste parameter wat GA-seinaktiwiteit beheer nie, aangesien dit van komplekse waarnemingsprosesse afhang. Hier, wat voortbou op ons begrip van die DELLA- en GA-seinpaaie, rapporteer ons die ontwikkeling en karakterisering van 'n degradasie-gebaseerde ratiometriese biosensor vir GA-sein. Om hierdie kwantitatiewe biosensor te ontwikkel, het ons 'n mutante GA-sensitiewe RGA gebruik wat aan 'n fluoresserende proteïen saamgesmelt is en alom in weefsels uitgedruk is, sowel as 'n GA-onsensitiewe fluoresserende proteïen. Ons toon dat die mutante RGA-proteïenfusies nie inmeng met endogene GA-sein wanneer dit alomteenwoordig uitgedruk word nie, en dat hierdie biosensor seinaktiwiteit kan kwantifiseer wat voortspruit uit beide GA-invoer en GA-seinverwerking deur die waarnemingsapparaat met hoë tydruimtelike resolusie. Ons het hierdie biosensor gebruik om die tydruimtelike verspreiding van GA-seinaktiwiteit te karteer en te kwantifiseer hoe GA sellulêre gedrag in die SAM-epidermis reguleer. Ons demonstreer dat GA die oriëntasie van die delingsvlak van SAM-selle wat tussen orgaanprimordia geleë is reguleer, en sodoende die kanoniese sellulêre organisasie van die internode definieer.
Ten slotte het ons gevra of qmRGA veranderinge in endogene GA-vlakke kan rapporteer met behulp van groeiende hipokotiele. Ons het voorheen gewys dat nitraat groei stimuleer deur GA-sintese en op sy beurt DELLA34-afbraak te verhoog. Gevolglik het ons waargeneem dat hipokotiellengte in pUBQ10::qmRGA saailinge wat onder oorvloedige nitraatvoorsiening (10 mM NO3-) gekweek is, aansienlik langer was as dié in saailinge wat onder nitraat-tekort toestande gekweek is (Aanvullende Fig. 6a). In ooreenstemming met die groeirespons, was GA-seine hoër in hipokotiele van saailinge wat onder 10 mM NO3− toestande gekweek is as in saailinge wat in die afwesigheid van nitraat gekweek is (Aanvullende Fig. 6b, c). Dus, qmRGA maak ook monitering moontlik van veranderinge in GA-sein wat veroorsaak word deur endogene veranderinge in GA-konsentrasie.
Om te verstaan of die GA-seinaktiwiteit wat deur qmRGA opgespoor word afhang van GA-konsentrasie en GA-persepsie, soos verwag gebaseer op die sensorontwerp, het ons die uitdrukking van die drie GID1-reseptore in vegetatiewe en reproduktiewe weefsels ontleed. In saailinge het die GID1-GUS verslaggewerlyn getoon dat GID1a en c hoogs uitgedruk word in saadlobbe (Fig. 3a–c). Daarbenewens is al drie reseptore uitgedruk in blare, laterale wortel primordia, wortelpunte (behalwe vir die wortelkap van GID1b) en die vaatstelsel (Fig. 3a-c). In die bloeiwyse SAM het ons GUS-seine slegs vir GID1b en 1c opgespoor (Aanvullende Fig. 7a–c). In situ hibridisasie het hierdie uitdrukkingspatrone bevestig en verder gedemonstreer dat GID1c eenvormig uitgedruk is teen lae vlakke in die SAM, terwyl GID1b hoër uitdrukking aan die periferie van die SAM getoon het (Aanvullende Fig. 7d-l). Die pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasiesamesmelting het ook 'n gegradeerde reeks GID1b uitdrukking geopenbaar, van lae of geen uitdrukking in die middel van die SAM tot hoë uitdrukking by die orgaangrense (Aanvullende Fig. 7m). GID1-reseptore word dus nie eenvormig oor en binne weefsels versprei nie. In daaropvolgende eksperimente het ons ook waargeneem dat ooruitdrukking van GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) die sensitiwiteit van qmRGA in hipokotiele vir eksterne GA-toepassing verhoog het (Fig. 3d, e). Daarteenoor was fluoressensie gemeet deur qd17mRGA in die hipokotiel onsensitief vir GA3-behandeling (Fig. 3f, g). Vir beide toetse is saailinge met hoë konsentrasies GA (100 μM GA3) behandel om die vinnige gedrag van die sensor te bepaal, waar die vermoë om aan die GID1-reseptor te bind verbeter of verloor is. Saam bevestig hierdie resultate dat die qmRGA-biosensor 'n gekombineerde funksie as 'n GA- en GA-sensor dien, en stel voor dat differensiële uitdrukking van die GID1-reseptor die emissiwiteit van die sensor aansienlik kan moduleer.
Tot op datum bly die verspreiding van GA-seine in die SAM onduidelik. Daarom het ons plante wat qmRGA uitdruk en die pCLV3 ::mCherry-NLS stamselverslaggewer35 gebruik om hoë-resolusie kwantitatiewe kaarte van GA seinaktiwiteit te bereken, met die fokus op die L1 laag (epidermis; Fig. 4a, b, sien Metodes en Aanvullende Metodes), aangesien L1 'n sleutelrol speel in SAM-beheer36. Hier het pCLV3 :: mCherry-NLS uitdrukking 'n vaste meetkundige verwysingspunt verskaf vir die ontleding van die tydruimtelike verspreiding van GA seinaktiwiteit37. Alhoewel GA as noodsaaklik beskou word vir laterale orgaanontwikkeling4, het ons waargeneem dat GA-seine laag was in die blomme primordium (P) vanaf die P3 stadium (Fig. 4a, b), terwyl jong P1 en P2 primordiums matige aktiwiteit soortgelyk aan dié in die sentrale streek gehad het (Fig. 4a, b). Hoër GA seinaktiwiteit is opgespoor by die orgaan primordium grense, begin by P1/P2 (aan die kante van die grens) en 'n hoogtepunt by P4, sowel as in alle selle van die perifere streek geleë tussen die primordia (Fig. 4a, b en Aanvullende Fig. 8a, b). Hierdie hoër GA seinaktiwiteit is nie net in die epidermis waargeneem nie, maar ook in die L2 en boonste L3 lae (Aanvullende Fig. 8b). Die patroon van GA seine opgespoor in die SAM met behulp van qmRGA het ook onveranderd gebly oor tyd (Aanvullende Fig. 8c-f, k). Alhoewel die qd17mRGA-konstruk sistematies in die SAM van T3-plante afgereguleer is vanaf vyf onafhanklike lyne wat ons in detail gekarakteriseer het, was ons in staat om die fluoressensiepatrone wat verkry is met die pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruksie (Aanvullende Fig. 8g–j, l) te ontleed. In hierdie kontrolelyn is slegs geringe veranderinge in die fluoressensieverhouding in die SAM opgespoor, maar in die SAM-sentrum het ons 'n duidelike en onverwagte afname in VENUS waargeneem wat met TagBFP geassosieer word. Dit bevestig dat die seinpatroon wat deur qmRGA waargeneem word, GA-afhanklike degradasie van mRGA-VENUS weerspieël, maar demonstreer ook dat qmRGA GA-seinaktiwiteit in die meristeemsentrum kan oorskat. Samevattend toon ons resultate 'n GA-seinpatroon wat hoofsaaklik die verspreiding van primordia weerspieël. Hierdie verspreiding van die inter-primordiale streek (IPR) is te wyte aan die geleidelike vestiging van hoë GA-seinaktiwiteit tussen die ontwikkelende primordium en die sentrale streek, terwyl GA-seinaktiwiteit in die primordium terselfdertyd afneem (Fig. 4c, d).
Die verspreiding van GID1b- en GID1c-reseptore (sien hierbo) dui daarop dat differensiële uitdrukking van GA-reseptore help om die patroon van GA-seinaktiwiteit in die SAM te vorm. Ons het gewonder of differensiële akkumulasie van GA betrokke kan wees. Om hierdie moontlikheid te ondersoek, het ons die nlsGPS1 GA FRET sensor21 gebruik. Verhoogde aktiveringsfrekwensie is opgespoor in die SAM van nlsGPS1 behandel met 10 μM GA4+7 vir 100 min (Aanvullende Fig. 9a–e), wat aandui dat nlsGPS1 reageer op veranderinge in GA konsentrasie in die SAM, soos dit in wortels21 doen. Ruimtelike verspreiding van nlsGPS1 aktiveringsfrekwensie het relatief lae GA-vlakke in die buitenste lae van die SAM geopenbaar, maar het getoon dat hulle in die middel en by die grense van die SAM verhef is (Fig. 4e en Aanvullende Fig. 9a,c). Dit dui daarop dat GA ook in die SAM versprei word met 'n ruimtelike patroon wat vergelykbaar is met dié wat deur qmRGA geopenbaar word. As 'n komplementêre benadering het ons ook die SAM met fluoresserende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of Fl alleen as 'n negatiewe kontrole behandel. Die Fl-sein is deur die SAM versprei, insluitend die sentrale streek en primordium, alhoewel teen 'n laer intensiteit (Fig. 4j en Aanvullende Fig. 10d). Daarteenoor het al drie GA-Fl spesifiek binne die primordium-grense en in verskillende mate in die res van die IPR opgehoop, met GA7-Fl wat in die grootste domein in die IPR opgehoop het (Fig. 4k en Aanvullende Fig. 10a,b). Kwantifisering van fluoressensie-intensiteit het aan die lig gebring dat die IPR tot nie-IPR-intensiteitsverhouding hoër was in GA-Fl-behandelde SAM in vergelyking met Fl-behandelde SAM (Fig. 4l en Aanvullende Fig. 10c). Saam dui hierdie resultate daarop dat GA teen hoër konsentrasies teenwoordig is in IPR-selle wat die naaste aan die orgaangrens geleë is. Dit dui daarop dat die patroon van SAM GA-seinaktiwiteit die gevolg is van beide differensiële uitdrukking van GA-reseptore en differensiële akkumulasie van GA in IPR-selle naby orgaangrense. Dus, ons analise het 'n onverwagte tydruimtelike patroon van GA-sein aan die lig gebring, met laer aktiwiteit in die middel en primordium van die SAM en hoër aktiwiteit in die IPR in die perifere streek.
Om die rol van differensiële GA-seinaktiwiteit in die SAM te verstaan, het ons die korrelasie tussen GA-seinaktiwiteit, seluitbreiding en seldeling ontleed deur intydse tydsverloopbeelding van die SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS te gebruik. Gegewe die rol van GA in groeiregulering, is 'n positiewe korrelasie met seluitbreidingsparameters verwag. Daarom het ons eers GA-seinaktiwiteitskaarte vergelyk met kaarte van seloppervlakgroeitempo (as 'n proxy vir die sterkte van seluitbreiding vir 'n gegewe sel en vir dogterselle by deling) en met kaarte van groeianisotropie, wat die rigting van seluitsetting meet (ook hier gebruik vir 'n gegewe sel en vir dogterselle by deling; Fig. 5a,b, sien Metodes en Aanvullende Metodes). Ons kaarte van SAM-seloppervlakgroeitempo stem ooreen met vorige waarnemings38,39, met minimale groeitempo's by die grens en maksimum groeitempo's in ontwikkelende blomme (Fig. 5a). Hoofkomponentanalise (PCA) het getoon dat GA-seinaktiwiteit negatief gekorreleer is met seloppervlakgroeiintensiteit (Figuur 5c). Ons het ook getoon dat die hoof-asse van variasie, insluitend GA-seininvoer en groei-intensiteit, ortogonaal was tot die rigting wat deur hoë CLV3-uitdrukking bepaal is, wat die uitsluiting van selle van die SAM-sentrum in die oorblywende ontledings bevestig. Spearman-korrelasie-analise het die PCA-resultate bevestig (Figuur 5d), wat aandui dat hoër GA-seine in die IPR nie hoër seluitbreiding tot gevolg gehad het nie. Korrelasie-analise het egter 'n effense positiewe korrelasie tussen GA-seinaktiwiteit en groeianisotropie getoon (Figuur 5c, d), wat daarop dui dat hoër GA-sein in die IPR die rigting van selgroei en moontlik die posisie van die seldelingsvlak beïnvloed.
a, b Hittekaarte van gemiddelde oppervlakgroei (a) en groeianisotropie (b) in SAM is gemiddeld oor sewe onafhanklike plante (onderskeidelik gebruik as gevolmagtigdes vir die sterkte en rigting van seluitsetting). c PCA-analise het die volgende veranderlikes ingesluit: GA-sein, oppervlakgroeiintensiteit, oppervlakgroeianisotropie en CLV3-uitdrukking. PCA komponent 1 was hoofsaaklik negatief gekorreleer met oppervlak groei intensiteit en positief gekorreleer met GA sein. PCA komponent 2 was hoofsaaklik positief gekorreleer met oppervlakgroei anisotropie en negatief gekorreleer met CLV3 uitdrukking. Persentasies verteenwoordig die variasie wat deur elke komponent verduidelik word. d Spearman-korrelasie-analise tussen GA-sein, oppervlakgroei-intensiteit en oppervlakgroei-anisotropie op die weefselskaal uitgesluit CZ. Die nommer aan die regterkant is die Spearman rho waarde tussen twee veranderlikes. Asterisks dui gevalle aan waar die korrelasie/negatiewe korrelasie hoogs betekenisvol is. e 3D-visualisering van Col-0 SAM L1-selle deur konfokale mikroskopie. Nuwe selwande wat in die SAM gevorm word (maar nie die primordium nie) op 10 uur word gekleur volgens hul hoekwaardes. Die kleurbalk word in die onderste regterhoek gewys. Die insetsel wys die ooreenstemmende 3D-beeld op 0 uur. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. f Boksplotte vertoon seldelingskoerse in IPR en nie-IPR Kol-0 SAM (n = 10 onafhanklike plante). Die middellyn wys die mediaan, en die blokkiesgrense dui die 25ste en 75ste persentiele aan. Snorre dui die minimum en maksimum waardes aan wat met R-sagteware bepaal word. P-waardes is verkry met Welch se tweestert-t-toets. g, h Skematiese diagram wat wys (g) hoe om die hoek van die nuwe selwand (magenta) met betrekking tot die radiale rigting vanaf die middel van die SAM (wit stippellyn) te meet (slegs skerphoekwaardes, dit wil sê, 0–90°, word in ag geneem), en (h) die omtrek/laterale en radiale rigtings binne die meristeem. i Frekwensiehistogramme van seldelingsvlakoriëntasie oor onderskeidelik die SAM (donkerblou), IPR (mediumblou) en nie-IPR (ligblou). P-waardes is verkry deur 'n tweestert Kolmogorov-Smirnov-toets. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. j Frekwensiehistogramme van seldelingsvlakoriëntasie van die IPR om onderskeidelik P3 (liggroen), P4 (mediumgroen) en P5 (donkergroen). P-waardes is verkry deur 'n tweestert Kolmogorov-Smirnov-toets. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate.
Daarom het ons vervolgens die korrelasie tussen GA-sein en seldeling-aktiwiteit ondersoek deur nuutgevormde selwande tydens die toets te identifiseer (Fig. 5e). Hierdie benadering het ons in staat gestel om die frekwensie en rigting van seldeling te meet. Verbasend genoeg het ons gevind dat die frekwensie van seldelings in die IPR en die res van die SAM (nie-IPR, Fig. 5f) soortgelyk was, wat aandui dat verskille in GA-sein tussen IPR en nie-IPR selle nie seldeling beduidend beïnvloed nie. Dit, en die positiewe korrelasie tussen GA-sein en groei-anisotropie, het ons aangespoor om te oorweeg of GA-seinaktiwiteit die oriëntasie van die seldelingsvlak kan beïnvloed. Ons het die oriëntasie van die nuwe selwand gemeet as 'n skerp hoek relatief tot die radiale as wat die meristeemmiddelpunt en die middelpunt van die nuwe selwand verbind (Fig. 5e-i) en het 'n duidelike neiging waargeneem vir selle om teen hoeke naby aan 90° relatief tot die radiale as te verdeel, met die hoogste frekwensies waargeneem by 8–20 %) (° 09 %). (22.62%) (Fig. 5e,i), wat ooreenstem met seldelings in die omtrek/dwarsrigting (Fig. 5h). Om die bydrae van GA-sein tot hierdie seldeling gedrag te ondersoek, het ons seldeling parameters in die IPR en nie-IPR afsonderlik ontleed (Fig. 5i). Ons het waargeneem dat die verdelingshoekverspreiding in IPR-selle verskil van dié in nie-IPR-selle of in selle in die hele SAM, met IPR-selle wat 'n hoër proporsie van laterale/sirkelvormige seldelings vertoon, dws 70-80° en 80-90° (33.86% en 30.71%, onderskeidelik) (Fig. Ons waarnemings het dus 'n assosiasie tussen hoë GA-sein en 'n seldeling-vlakoriëntasie naby die omtreksrigting aan die lig gebring, soortgelyk aan die korrelasie tussen GA-seinaktiwiteit en groeianisotropie (Fig. 5c, d). Om die ruimtelike bewaring van hierdie assosiasie verder vas te stel, het ons die verdelingsvlakoriëntasie in IPR-selle wat die primordium omring vanaf P3 gemeet, aangesien die hoogste GA-seinaktiwiteit in hierdie streek opgespoor is vanaf P4 (Fig. 4). Die verdelingshoeke van die IPR rondom P3 en P4 het geen statisties betekenisvolle verskille getoon nie, alhoewel 'n verhoogde frekwensie van laterale seldelings in die IPR rondom P4 waargeneem is (Fig. 5j). In die IPR-selle rondom P5 het die verskil in die oriëntasie van die seldelingsvlak egter statisties betekenisvol geword, met 'n skerp toename in die frekwensie van transversale seldelings (Fig. 5j). Saam dui hierdie resultate daarop dat GA-sein die oriëntasie van seldelings in die SAM kan beheer, wat ooreenstem met vorige verslae40,41 dat hoë GA-sein laterale oriëntasie van seldelings in die IPR kan veroorsaak.
Daar word voorspel dat selle in die IPR nie in primordia geïnkorporeer sal word nie, maar eerder in internodes2,42,43. Die transversale oriëntasie van seldelings in die IPR kan lei tot die tipiese organisasie van parallelle longitudinale rye epidermale selle in internodes. Ons waarnemings wat hierbo beskryf is, dui daarop dat GA-sein waarskynlik 'n rol speel in hierdie proses deur die rigting van seldeling te reguleer.
Verlies aan funksie van verskeie DELLA-gene lei tot 'n konstitutiewe GA-reaksie, en della-mutante kan gebruik word om hierdie hipotese te toets44. Ons het eers die uitdrukkingspatrone van vyf DELLA-gene in die SAM ontleed. Transkripsiesamesmelting van die GUS-lyn45 het aan die lig gebring dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (in 'n baie mindere mate) in die SAM uitgedruk is (Aanvullende Fig. 11a–d). In situ hibridisasie het verder gedemonstreer dat GAI mRNA spesifiek in primordia en ontwikkelende blomme ophoop (Aanvullende Fig. 11e). RGL1 en RGL3 mRNA is regdeur die SAM blaredak en in ouer blomme opgespoor, terwyl RGL2 mRNA meer volop in die grensgebied was (Aanvullende Fig. 11f–h). Konfokale beelding van pRGL3::RGL3-GFP SAM het die uitdrukking bevestig wat deur in situ hibridisasie waargeneem is en het getoon dat RGL3 proteïen in die sentrale deel van die SAM ophoop (Aanvullende Fig. 11i). Deur die pRGA::GFP-RGA-lyn te gebruik, het ons ook gevind dat RGA-proteïen in die SAM ophoop, maar die oorvloed daarvan verminder by die grens vanaf P4 (Aanvullende Fig. 11j). Die uitdrukkingspatrone van RGL3 en RGA is veral in ooreenstemming met hoër GA-seinaktiwiteit in die IPR, soos opgespoor deur qmRGA (Fig. 4). Boonop dui hierdie data aan dat alle DELLA's in die SAM uitgedruk word en dat hul uitdrukking gesamentlik die hele SAM strek.
Ons ontleed vervolgens die seldeling parameters in die wilde-tipe SAM (Ler, kontrole) en die gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della vyfvoudig (globale) mutante (Fig. 6a, b). Interessant genoeg het ons 'n statisties beduidende verskuiwing in die verspreiding van seldelinghoekfrekwensies in die della globale mutant SAM waargeneem in vergelyking met die wilde tipe (Fig. 6c). Hierdie verandering in die della globale mutant was as gevolg van 'n toename in die frekwensie van 80–90° hoeke (34.71% vs. 24.55%) en, tot 'n mindere mate, 70–80° hoeke (23.78% vs. 20.18%), dit wil sê, wat ooreenstem met transversale seldelings (Fig. 6c). Die frekwensie van nie-dwarsverdelings (0-60°) was ook laer in die della globale mutant (Fig. 6c). Die frekwensie van transversale seldelings is aansienlik verhoog in die SAM van die della globale mutant (Fig. 6b). Die frekwensie van transversale seldelings in die IPR was ook hoër in die della globale mutant in vergelyking met die wilde tipe (Fig. 6d). Buite die IPR-streek het die wilde tipe 'n meer eenvormige verspreiding van seldelingshoeke gehad, terwyl die della globale mutant tangensiële afdelings soos die IPR verkies het (Fig. 6e). Ons het ook die oriëntasie van seldelings in die SAM van ga2-oksidase (ga2ox) vyfvoudige mutante (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 en ga2ox6-2) gekwantifiseer, 'n GA-onaktiewe mutantagtergrond waarin GA ophoop. In ooreenstemming met die toename in GA-vlakke, was die SAM van die vyfvoudige ga2ox mutante bloeiwyse groter as dié van Kol-0 (Aanvullende Fig. 12a, b), en in vergelyking met Kol-0, het die vyfvoudige ga2ox SAM 'n duidelik verskillende verspreiding van seldelingshoeke getoon, met die tangensiale frekwensie van 500° tot weer toenemende hoek 500°e. afdelings (Aanvullende Fig. 12a–c). Ons wys dus dat konstitutiewe aktivering van GA-sein en GA-akkumulasie laterale seldelings in die IPR en die res van die SAM veroorsaak.
a, b 3D-visualisering van die L1-laag van PI-gekleurde Ler (a) en globale della mutant (b) SAM met behulp van konfokale mikroskopie. Nuwe selwande wat in die SAM gevorm is (maar nie die primordium nie) oor 'n 10-uur periode word getoon en gekleur volgens hul hoekwaardes. Die inlas wys die SAM by 0 h. Die kleurbalk word in die onderste regterhoek vertoon. Die pyltjie in (b) wys na 'n voorbeeld van belynde sellêers in die globale della-mutant. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. ce vergelyking van die frekwensie verspreiding van seldeling vlak oriëntasies in die hele SAM (d), IPR (e), en nie-IPR (f) tussen Ler en globale della. P-waardes is verkry met behulp van 'n tweestert Kolmogorov-Smirnov-toets. f, g 3D-visualisering van konfokale beelde van PI-gekleurde SAM van Kol-0 (i) en pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeniese plante. Panele (a, b) toon nuwe selwande (maar nie primordia nie) wat binne 10 uur in die SAM gevorm is. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. h–j Vergelyking van die frekwensieverspreiding van seldelingsvlakoriëntasies geleë in die hele SAM (h), IPR (i) en nie-IPR (j) tussen Kol-0 en pCUC2::gai-1-VENUS plante. P-waardes is verkry met behulp van 'n tweestert Kolmogorov-Smirnov-toets.
Ons het vervolgens die effek van die inhibering van GA-sein spesifiek in die IPR getoets. Vir hierdie doel het ons die saadlobbe beker 2 (CUC2) promotor gebruik om uitdrukking van 'n dominante negatiewe gai-1 proteïen saamgesmelt aan VENUS (in die pCUC2::gai-1-VENUS lyn) te dryf. In die wild-tipe SAM, dryf die CUC2 promotor uitdrukking van die meeste IPRs in die SAM, insluitend grensselle, vanaf P4 en verder, en soortgelyke spesifieke uitdrukking is waargeneem in pCUC2::gai-1-VENUS plante (sien hieronder). Die verspreiding van seldelingshoeke oor die SAM of IPR van pCUC2 ::gai-1-VENUS plante was nie betekenisvol verskillend van dié van die wilde tipe nie, alhoewel ons onverwags gevind het dat selle sonder 'n IPR in hierdie plante teen 'n hoër frekwensie van 80–90° verdeel het (Fig. 6f–j).
Daar is voorgestel dat die rigting van seldeling afhang van die geometrie van die SAM, veral die trekspanning wat deur die weefselkromming gegenereer word46. Ons het dus gevra of die vorm van die SAM in die della globale mutant en pCUC2::gai-1-VENUS plante verander is. Soos voorheen gerapporteer12, was die grootte van die della globale mutant SAM groter as dié van die wilde tipe (Aanvullende Fig. 13a, b, d). In situ hibridisasie van CLV3 en STM RNA het die meristeem uitbreiding in della mutante bevestig en het verder die laterale uitbreiding van die stamsel nis getoon (Aanvullende Fig. 13e, f, h, i). Die SAM-kromming was egter soortgelyk in beide genotipes (Aanvullende Fig. 13k, m, n, p). Ons het 'n soortgelyke toename in grootte in die gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della viervoudige mutant waargeneem sonder 'n verandering in kromming in vergelyking met die wilde tipe (Aanvullende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Die frekwensie van seldeling-oriëntasie is ook beïnvloed in die della-viervoudige mutant, maar in 'n mindere mate as in die della monolitiese mutant (Aanvullende Fig. 12d–f). Hierdie dosis-effek, tesame met die gebrek aan 'n effek op kromming, dui daarop dat oorblywende RGL3-aktiwiteit in die Della-viervoudige mutant veranderinge in seldeling-oriëntasie wat veroorsaak word deur verlies van DELLA-aktiwiteit beperk en dat veranderinge in laterale seldelings plaasvind in reaksie op veranderinge in GA-seinaktiwiteit eerder as veranderinge in SAM-geometrie. Soos hierbo beskryf, dryf die CUC2-promotor IPR-uitdrukking in die SAM vanaf P4 (Aanvullende Fig. 14a, b), en in teenstelling hiermee het die pCUC2::gai-1-VENUS SAM 'n verminderde grootte, maar hoër kromming gehad (Aanvullende Fig. 14c-h). Hierdie verandering in pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologie kan lei tot 'n ander verspreiding van meganiese spanning in vergelyking met die wilde tipe, waarin hoë omtrekspannings op 'n korter afstand vanaf die SAM-sentrum begin47. Alternatiewelik kan die veranderinge in pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morfologie voortspruit uit veranderinge in streeks meganiese eienskappe geïnduseer deur transgeen uitdrukking48. In beide gevalle kan dit die uitwerking van veranderinge in GA-seine gedeeltelik verreken deur die waarskynlikheid te verhoog dat selle in die omtrek/dwars oriëntasie sal verdeel, wat ons waarnemings verduidelik.
Saamgevat bevestig ons data dat hoër GA-sein 'n aktiewe rol speel in die laterale oriëntasie van die seldelingsvlak in die IPR. Hulle toon ook dat meristeemkromming ook die oriëntasie van die seldelingsvlak in die IPR beïnvloed.
Die transversale oriëntasie van die delingsvlak in die IPR, as gevolg van hoë GA seinaktiwiteit, dui daarop dat GA 'n radiale sellêer in die epidermis binne die SAM vooraf organiseer om die sellulêre organisasie te definieer wat later in die epidermale internode gevind sal word. Inderdaad, sulke sel lêers was gereeld sigbaar in SAM beelde van della globale mutante (Fig. 6b). Om dus die ontwikkelingsfunksie van die ruimtelike patroon van GA-sein in die SAM verder te verken, het ons tydsverloopbeelding gebruik om die ruimtelike organisasie van selle in die IPR in wildtipe (Ler en Col-0), della globale mutante en pCUC2::gai-1-VENUS transgeniese plante te ontleed.
Ons het gevind dat qmRGA getoon het dat GA-seinaktiwiteit in die IPR toegeneem het vanaf P1/P2 en 'n hoogtepunt bereik het by P4, en hierdie patroon het konstant gebly oor tyd (Fig. 4a-f en Aanvullende Fig. 8c-f, k). Om die ruimtelike organisasie van selle in die IPR met toenemende GA-sein te ontleed, het ons Ler IPR-selle bo en aan die kante van P4 gemerk volgens hul ontwikkelingslot wat 34 uur na eerste waarneming ontleed is, dit wil sê, meer as twee plastiedtye, wat ons toelaat om IPR-selle te volg tydens primordium-ontwikkeling van P1/P2 na P4. Ons het drie verskillende kleure gebruik: geel vir daardie selle wat in die primordium naby P4 geïntegreer is, groen vir dié wat in die IPR was, en pers vir diegene wat aan beide prosesse deelgeneem het (Fig. 7a-c). By t0 (0 h), was 1-2 lae IPR-selle sigbaar voor P4 (Fig. 7a). Soos verwag, toe hierdie selle verdeel het, het hulle dit hoofsaaklik via die dwarsdelingsvlak gedoen (Fig. 7a–c). Soortgelyke resultate is verkry met behulp van Col-0 SAM (fokus op P3, wie se rand vou soortgelyk aan P4 in Ler), alhoewel in hierdie genotipe die vou wat by die blomgrens gevorm word die IPR-selle vinniger weggesteek het (Fig. 7g-i). Dus, die verdelingspatroon van IPR-selle organiseer die selle vooraf in radiale rye, soos in internodes. Die organisasie van radiale rye en die lokalisering van IPR-selle tussen opeenvolgende organe dui daarop dat hierdie selle internodale stamvaders is.
Hier het ons 'n ratiometriese GA-seinbiosensor, qmRGA, ontwikkel wat kwantitatiewe kartering van GA-seinaktiwiteit moontlik maak wat voortspruit uit gekombineerde GA- en GA-reseptorkonsentrasies, terwyl interferensie met endogene seinpaaie tot die minimum beperk word, en sodoende inligting verskaf oor GA-funksie op sellulêre vlak. Vir hierdie doel het ons 'n gemodifiseerde DELLA-proteïen, mRGA, gekonstrueer wat die vermoë verloor het om DELLA-interaksievennote te bind, maar sensitief bly vir GA-geïnduseerde proteolise. qmRGA reageer op beide eksogene en endogene veranderinge in GA-vlakke, en sy dinamiese waarnemingseienskappe maak assessering van tydruimtelike veranderinge in GA-seinaktiwiteit tydens ontwikkeling moontlik. qmRGA is ook 'n baie buigsame instrument, aangesien dit by verskillende weefsels aangepas kan word deur die promotor wat vir sy uitdrukking gebruik word te verander (indien nodig), en gegewe die bewaarde aard van die GA-seinweg en die PFYRE-motief oor angiosperme, is dit waarskynlik oordraagbaar na ander spesies22. In ooreenstemming hiermee, is ook getoon dat 'n ekwivalente mutasie in die rys SLR1 DELLA proteïen (HYY497AAA) die groeionderdrukker aktiwiteit van SLR1 onderdruk terwyl dit net effens sy GA-gemedieerde degradasie verminder, soortgelyk aan mRGA23. Opmerklik, onlangse studies in Arabidopsis het getoon dat 'n enkele aminosuurmutasie in die PFYRE-domein (S474L) die transkripsie-aktiwiteit van RGA verander het sonder om sy vermoë om met transkripsiefaktorvennote te interaksie te beïnvloed50. Alhoewel hierdie mutasie baie naby aan die 3 aminosuursubstitusies teenwoordig in mRGA is, toon ons studies dat hierdie twee mutasies verskillende kenmerke van DELLA verander. Alhoewel die meeste transkripsiefaktorvennote aan die LHR1- en SAW-domeine van DELLA26,51 bind, kan sommige bewaarde aminosure in die PFYRE-domein help om hierdie interaksies te stabiliseer.
Internode-ontwikkeling is 'n sleutelkenmerk in plantargitektuur en opbrengsverbetering. qmRGA het hoër GA seinaktiwiteit in IPR internode stamvaderselle geopenbaar. Deur kwantitatiewe beeldvorming en genetika te kombineer, het ons getoon dat GA-seinpatrone sirkelvormige/transversale seldelingsvlakke in die SAM-epidermis op mekaar plaas, wat die seldeling-organisasie wat nodig is vir internode-ontwikkeling vorm. Verskeie reguleerders van seldelingsvlakoriëntasie is tydens ontwikkeling geïdentifiseer52,53. Ons werk bied 'n duidelike voorbeeld van hoe GA-seinaktiwiteit hierdie sellulêre parameter reguleer. DELLA kan interaksie hê met voorafvouende proteïenkomplekse41, so GA-sein kan seldelingsvlakoriëntasie reguleer deur kortikale mikrotubuli-oriëntasie direk te beïnvloed40,41,54,55. Ons het onverwags gewys dat in SAM, die korrelaat van hoër GA-seinaktiwiteit nie selverlenging of -deling was nie, maar slegs groeianisotropie, wat ooreenstem met 'n direkte effek van GA op die rigting van seldeling in die IPR. Ons kan egter nie uitsluit dat hierdie effek ook indirek kan wees nie, byvoorbeeld bemiddel deur GA-geïnduseerde selwandversagting56. Veranderinge in selwandeienskappe veroorsaak meganiese spanning57,58, wat ook die oriëntasie van die seldelingsvlak kan beïnvloed deur die oriëntasie van kortikale mikrotubuli te beïnvloed39,46,59. Die gekombineerde effekte van GA-geïnduseerde meganiese spanning en direkte regulering van mikrotubuli-oriëntasie deur GA kan betrokke wees by die generering van 'n spesifieke patroon van seldeling-oriëntasie in die IPR om internodes te definieer, en verdere studies is nodig om hierdie idee te toets. Eweneens het vorige studies die belangrikheid van die DELLA-interaksie proteïene TCP14 en 15 in die beheer van internode vorming uitgelig60,61 en hierdie faktore kan die werking van GA tesame met BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY) bemiddel wat internode ontwikkeling reguleer en daar is getoon dat dit 62GA sein2 beïnvloed. Gegewe dat DELLA's interaksie het met brassinosteroïed-, etileen-, jasmoniese suur- en absisiensuur (ABA) seinweë63,64 en dat hierdie hormone mikrotubuli-oriëntasie kan beïnvloed65, kan die effekte van GA op seldeling-oriëntasie ook deur ander hormone bemiddel word.
Vroeë sitologiese studies het getoon dat beide die binneste en buitenste streke van die Arabidopsis SAM benodig word vir internode ontwikkeling2,42. Die feit dat GA aktief seldeling in die binneste weefsels reguleer12 ondersteun 'n dubbele funksie van GA in die regulering van meristeem en internodegrootte in die SAM. Die patroon van rigtingseldeling word ook styf gereguleer in die binneste SAM-weefsel, en hierdie regulering is noodsaaklik vir stamgroei52. Dit sal interessant wees om te ondersoek of GA ook 'n rol speel in die oriëntering van die seldelingsvlak in die binne-SAM-organisasie, en sodoende die spesifikasie en ontwikkeling van internodes binne die SAM sinchroniseer.
Plante is in vitro gekweek in grond of 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) aangevul met 1% sukrose en 1% agar (Sigma) onder standaard toestande (16 uur lig, 22 °C), behalwe vir hipokotiel en wortelgroei eksperimente waarin saailinge onder konstante lig en 22 °C op vertikale plate gekweek is. Vir nitraat-eksperimente is plante op gemodifiseerde MS-medium (bioWORLD-plantmedium) aangevul met voldoende nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinaat, 1% sukrose en 1% A-agar (Sigma) onder langdagtoestande gekweek.
GID1a cDNA ingevoeg in pDONR221 is herkombineer met pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW om pUBQ10::GID1a-mCherry te genereer. IDD2 DNA wat in pDONR221 ingevoeg is, is in pB7RWG266 herkombineer om p35S:IDD2-RFP te genereer. Om pGID1b::2xmTQ2-GID1b te genereer, is 'n 3.9 kb-fragment stroomop van die GID1b-koderende streek en 'n 4.7 kb-fragment wat die GID1b-cDNA (1.3 kb) en terminator (3.4 kb) bevat, eers geamplifiseer deur gebruik te maak van die primers in Aanvullende Tabel 43 en daarna in PNRs-Tabel 43. Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), onderskeidelik, en uiteindelik herkombineer met pDONR221 2xmTQ268 in die pGreen 012567 teikenvektor deur gebruik te maak van Gateway-kloning. Om pCUC2::LSSmOrange te genereer, is die CUC2-promotorvolgorde (3229 bp stroomop van ATG) gevolg deur die koderingsvolgorde van groot Stokes-verskuifde mOrange (LSSmOrange)69 met die N7-kernlokaliseringsein en die NOS-transkripsieterminator saamgestel in die pGreen-teikenvektor-kanamy-fragment-stelsel vir die pGreenway-recombination-recombination. (Invitrogen). Die plant binêre vektor is ingebring in Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 en ingebring in Nicotiana benthamiana blare deur Agrobacterium infiltrasie metode en in Arabidopsis thaliana Col-0 deur floral dip metode, onderskeidelik. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry en pCLV3::mCherry-NLS qmRGA is onderskeidelik van die F3 en F1 nageslagte van die onderskeie kruisings geïsoleer.
RNA in situ hibridisasie is uitgevoer op ongeveer 1 cm lange lootpunte72, wat versamel en onmiddellik in FAA oplossing (3.7% formaldehied, 5% asynsuur, 50% etanol) vooraf verkoel tot 4 °C gefixeer is. Na 2 × 15 minute vakuumbehandelings is die fiksasiemiddel verander en monsters is oornag geïnkubeer. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 en RGL3 cDNAs en antisense probes vir hul 3'-UTRs is gesintetiseer deur gebruik te maak van die primers getoon in Aanvullende Tabel 3 soos beskryf deur Rosier et al.73. Digoksigenien-gemerkte probes is immuunopgespoor deur gebruik te maak van digoksigenien-teenliggaampies (3000-voudige verdunning; Roche, katalogusnommer: 11 093 274 910), en snitte is gekleur met 5-broom-4-chloor-3-indolielfosfaat (BCIP, 250-voudige diludium (N) 200-voudige verdunning) oplossing.
Postyd: 10 Februarie 2025