Die groei van die apikale meristeem (SAM) is krities vir stamargitektuur. Planthormonegibberelliene(GA's) speel sleutelrolle in die koördinering van plantgroei, maar hul rol in die SAM bly swak verstaan. Hier het ons 'n ratiometriese biosensor van GA-seintranskripsie ontwikkel deur die DELLA-proteïen te manipuleer om sy noodsaaklike regulatoriese funksie in die GA-transkripsierespons te onderdruk terwyl die afbraak daarvan na GA-herkenning behoue bly. Ons demonstreer dat hierdie afbraak-gebaseerde biosensor veranderinge in GA-vlakke en sellulêre waarneming tydens ontwikkeling akkuraat aanteken. Ons het hierdie biosensor gebruik om GA-seinaktiwiteit in die SAM te karteer. Ons toon dat hoë GA-seine hoofsaaklik teenwoordig is in selle wat tussen orgaanprimordia geleë is, wat voorlopers van internodusselle is. Deur gebruik te maak van wins- en verlies-van-funksie-benaderings, demonstreer ons verder dat GA die oriëntasie van die seldelingsvlak reguleer, wat die kanonieke sellulêre organisasie van internodes vestig, en sodoende internodusspesifikasie in die SAM bevorder.
Die lootapikale meristeem (SAM), geleë by die lootpunt, bevat 'n nis van stamselle waarvan die aktiwiteit laterale organe en stamknope op 'n modulêre en iteratiewe wyse dwarsdeur die plant se lewe genereer. Elk van hierdie herhalende eenhede, of plantknope, sluit internodes en laterale organe by die knope in, en okselmeristeme in die blaaroksels1. Die groei en organisasie van plantknope verander tydens ontwikkeling. In Arabidopsis word internodale groei onderdruk tydens die vegetatiewe stadium, en okselmeristeme bly dormant in die oksels van rosetblare. Tydens die oorgang na die blomfase word die SAM die bloeiwysemeriesteem, wat verlengde internodes en okselknoppe, takkies in die oksels van stingelblare, en later blaarlose blomme2 genereer. Alhoewel ons beduidende vordering gemaak het in die begrip van die meganismes wat die inisiasie van blare, blomme en takke beheer, is relatief min bekend oor hoe internodes ontstaan.
Begrip van die spatiotemporale verspreiding van GA's sal help om die funksies van hierdie hormone in verskillende weefsels en in verskillende ontwikkelingsfases beter te verstaan. Visualisering van die afbraak van RGA-GFP-fusie wat uitgedruk word onder die werking van sy eie promotor, verskaf belangrike inligting oor die regulering van totale GA-vlakke in wortels15,16. RGA-uitdrukking wissel egter tussen weefsels17 en word deur GA18 gereguleer. Dus kan differensiële uitdrukking van die RGA-promotor lei tot die fluoresensiepatroon wat met RGA-GFP waargeneem word, en dus is hierdie metode nie kwantitatief nie. Meer onlangs het bioaktiewe fluoressien (Fl)-gemerkte GA19,20 die ophoping van GA in die wortelendokorteks en die regulering van sy sellulêre vlakke deur GA-transport aan die lig gebring. Onlangs het die GA FRET-sensor nlsGPS1 getoon dat GA-vlakke korreleer met selverlenging in wortels, filamente en donkergegroeide hipokotiele21. Soos ons egter gesien het, is GA-konsentrasie nie die enigste parameter wat GA-seinaktiwiteit beheer nie, aangesien dit afhanklik is van komplekse waarnemingsprosesse. Hier, voortbouend op ons begrip van die DELLA- en GA-seinweë, rapporteer ons die ontwikkeling en karakterisering van 'n degradasie-gebaseerde ratiometriese biosensor vir GA-seintransduksie. Om hierdie kwantitatiewe biosensor te ontwikkel, het ons 'n mutante GA-sensitiewe RGA gebruik wat met 'n fluorescerende proteïen gefuseer is en alomteenwoordig in weefsels uitgedruk is, sowel as 'n GA-onsensitiewe fluorescerende proteïen. Ons toon aan dat die mutante RGA-proteïenfusies nie met endogene GA-seintransduksie inmeng wanneer dit alomteenwoordig uitgedruk word nie, en dat hierdie biosensor seinaktiwiteit kan kwantifiseer wat voortspruit uit beide GA-invoer en GA-seinverwerking deur die sensoriese apparaat met hoë spatiotemporale resolusie. Ons het hierdie biosensor gebruik om die spatiotemporale verspreiding van GA-seinaktiwiteit te karteer en te kwantifiseer hoe GA sellulêre gedrag in die SAM-epidermis reguleer. Ons demonstreer dat GA die oriëntasie van die delingsvlak van SAM-selle wat tussen orgaanprimordia geleë is, reguleer, en sodoende die kanonieke sellulêre organisasie van die internodus definieer.
Laastens het ons gevra of qmRGA veranderinge in endogene GA-vlakke kon rapporteer deur groeiende hipokotiele te gebruik. Ons het voorheen getoon dat nitraat groei stimuleer deur GA-sintese te verhoog en, op sy beurt, DELLA34-afbraak. Gevolglik het ons waargeneem dat die hipokotiellengte in pUBQ10::qmRGA-saailinge wat onder oorvloedige nitraattoevoer (10 mM NO3−) gekweek is, aansienlik langer was as dié in saailinge wat onder nitraat-gebrekkige toestande gekweek is (Aanvullende Fig. 6a). In ooreenstemming met die groeirespons, was GA-seine hoër in hipokotiele van saailinge wat onder 10 mM NO3−-toestande gekweek is as in saailinge wat in die afwesigheid van nitraat gekweek is (Aanvullende Fig. 6b, c). Dus maak qmRGA ook die monitering van veranderinge in GA-seintransduksie moontlik wat deur endogene veranderinge in GA-konsentrasie veroorsaak word.
Om te verstaan of die GA-seinaktiwiteit wat deur qmRGA waargeneem word, afhang van GA-konsentrasie en GA-persepsie, soos verwag gebaseer op die sensorontwerp, het ons die uitdrukking van die drie GID1-reseptore in vegetatiewe en reproduktiewe weefsels geanaliseer. In saailinge het die GID1-GUS-verslaggewerlyn getoon dat GID1a en c hoogs uitgedruk was in saadlobbe (Fig. 3a-c). Daarbenewens is al drie reseptore uitgedruk in blare, laterale wortelprimordia, wortelpunte (behalwe vir die wortelmus van GID1b) en die vaskulêre stelsel (Fig. 3a-c). In die bloeiwyse-SAM het ons slegs GUS-seine vir GID1b en 1c waargeneem (Aanvullende Fig. 7a-c). In situ-hibridisasie het hierdie uitdrukkingspatrone bevestig en verder gedemonstreer dat GID1c eenvormig op lae vlakke in die SAM uitgedruk is, terwyl GID1b hoër uitdrukking aan die periferie van die SAM getoon het (Aanvullende Fig. 7d-l). Die pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasionele fusie het ook 'n gegradeerde reeks GID1b-uitdrukking getoon, van lae of geen uitdrukking in die middel van die SAM tot hoë uitdrukking by die orgaangrense (Aanvullende Fig. 7m). Dus is GID1-reseptore nie eenvormig versprei oor en binne weefsels nie. In daaropvolgende eksperimente het ons ook waargeneem dat ooruitdrukking van GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) die sensitiwiteit van qmRGA in hipokotiele vir eksterne GA-toediening verhoog het (Fig. 3d, e). In teenstelling hiermee was fluoresensie gemeet deur qd17mRGA in die hipokotiel ongevoelig vir GA3-behandeling (Fig. 3f, g). Vir beide toetse is saailinge behandel met hoë konsentrasies GA (100 μM GA3) om die vinnige gedrag van die sensor te bepaal, waar die vermoë om aan die GID1-reseptor te bind, verbeter of verlore gegaan het. Saam bevestig hierdie resultate dat die qmRGA-biosensor 'n gekombineerde funksie as 'n GA- en GA-sensor dien, en dui daarop dat differensiële uitdrukking van die GID1-reseptor die emissiwiteit van die sensor aansienlik kan moduleer.
Tot op hede bly die verspreiding van GA-seine in die SAM onduidelik. Daarom het ons qmRGA-ekspresserende plante en die pCLV3::mCherry-NLS stamselverslaggewer35 gebruik om hoëresolusie kwantitatiewe kaarte van GA-seinaktiwiteit te bereken, met die fokus op die L1-laag (epidermis; Fig. 4a, b, sien Metodes en Aanvullende Metodes), aangesien L1 'n sleutelrol speel in die beheer van SAM-groei36. Hier het pCLV3::mCherry-NLS-ekspressie 'n vaste geometriese verwysingspunt verskaf vir die analise van die ruimtelike en tydelike verspreiding van GA-seinaktiwiteit37. Alhoewel GA as noodsaaklik beskou word vir laterale orgaanontwikkeling4, het ons waargeneem dat GA-seine laag was in die blomprimordium (P) vanaf die P3-stadium (Fig. 4a, b), terwyl jong P1- en P2-primordiums matige aktiwiteit soortgelyk aan dié in die sentrale streek gehad het (Fig. 4a, b). Hoër GA-seinaktiwiteit is by die orgaanprimordiumgrense waargeneem, beginnende by P1/P2 (aan die kante van die grens) en met 'n piek by P4, sowel as in alle selle van die perifere gebied tussen die primordia (Fig. 4a, b en Aanvullende Fig. 8a, b). Hierdie hoër GA-seinaktiwiteit is nie net in die epidermis waargeneem nie, maar ook in die L2- en boonste L3-lae (Aanvullende Fig. 8b). Die patroon van GA-seine wat in die SAM met behulp van qmRGA waargeneem is, het ook oor tyd onveranderd gebly (Aanvullende Fig. 8c–f, k). Alhoewel die qd17mRGA-konstruk sistematies afgereguleer is in die SAM van T3-plante van vyf onafhanklike lyne wat ons in detail gekarakteriseer het, kon ons die fluoresensiepatrone wat met die pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruk verkry is, analiseer (Aanvullende Fig. 8g–j, l). In hierdie kontrolelyn is slegs geringe veranderinge in die fluoresensieverhouding in die SAM waargeneem, maar in die SAM-sentrum het ons 'n duidelike en onverwagte afname in VENUS geassosieer met TagBFP waargeneem. Dit bevestig dat die seinpatroon wat deur qmRGA waargeneem word, GA-afhanklike afbraak van mRGA-VENUS weerspieël, maar toon ook aan dat qmRGA GA-seinaktiwiteit in die meristeemsentrum kan oorskat. Samevattend toon ons resultate 'n GA-seinpatroon wat hoofsaaklik die verspreiding van primordia weerspieël. Hierdie verspreiding van die inter-primordiale gebied (IPR) is te wyte aan die geleidelike vestiging van hoë GA-seinaktiwiteit tussen die ontwikkelende primordium en die sentrale gebied, terwyl GA-seinaktiwiteit in die primordium terselfdertyd afneem (Fig. 4c, d).
Die verspreiding van GID1b- en GID1c-reseptore (sien hierbo) dui daarop dat differensiële uitdrukking van GA-reseptore help om die patroon van GA-seinaktiwiteit in die SAM te vorm. Ons het gewonder of differensiële akkumulasie van GA betrokke mag wees. Om hierdie moontlikheid te ondersoek, het ons die nlsGPS1 GA FRET-sensor21 gebruik. Verhoogde aktiveringsfrekwensie is waargeneem in die SAM van nlsGPS1 wat behandel is met 10 μM GA4+7 vir 100 min (Aanvullende Fig. 9a-e), wat aandui dat nlsGPS1 reageer op veranderinge in GA-konsentrasie in die SAM, soos dit in wortels21 doen. Ruimtelike verspreiding van nlsGPS1-aktiveringsfrekwensie het relatief lae GA-vlakke in die buitenste lae van die SAM getoon, maar het getoon dat hulle verhoog was in die middel en aan die grense van die SAM (Fig. 4e en Aanvullende Fig. 9a,c). Dit dui daarop dat GA ook in die SAM versprei is met 'n ruimtelike patroon vergelykbaar met dié wat deur qmRGA getoon word. As 'n komplementêre benadering het ons ook die SAM met fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of Fl alleen as 'n negatiewe kontrole behandel. Die Fl-sein is deur die SAM versprei, insluitend die sentrale streek en primordium, alhoewel teen 'n laer intensiteit (Fig. 4j en Aanvullende Fig. 10d). In teenstelling hiermee het al drie GA-Fl spesifiek binne die primordiumgrense en in verskillende mate in die res van die IPR opgehoop, met GA7-Fl wat in die grootste domein in die IPR opgehoop het (Fig. 4k en Aanvullende Fig. 10a,b). Kwantifisering van fluoresensie-intensiteit het getoon dat die IPR tot nie-IPR intensiteitsverhouding hoër was in GA-Fl-behandelde SAM in vergelyking met Fl-behandelde SAM (Fig. 4l en Aanvullende Fig. 10c). Saam dui hierdie resultate daarop dat GA teenwoordig is teen hoër konsentrasies in IPR-selle wat die naaste aan die orgaangrens geleë is. Dit dui daarop dat die patroon van SAM GA-seintransduksie-aktiwiteit voortspruit uit beide differensiële uitdrukking van GA-reseptore en differensiële akkumulasie van GA in IPR-selle naby orgaangrense. Dus het ons analise 'n onverwagte ruimtelike-temporale patroon van GA-seintransduksie aan die lig gebring, met laer aktiwiteit in die middel en primordium van die SAM en hoër aktiwiteit in die IPR in die perifere gebied.
Om die rol van differensiële GA-seinaktiwiteit in die SAM te verstaan, het ons die korrelasie tussen GA-seinaktiwiteit, seluitbreiding en seldeling geanaliseer deur gebruik te maak van intydse tydverloopbeelding van die SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Gegewe die rol van GA in groeiregulering, is 'n positiewe korrelasie met seluitbreidingsparameters verwag. Daarom het ons eers GA-seinaktiwiteitskaarte vergelyk met kaarte van seloppervlakgroeitempo (as 'n plaasvervanger vir die sterkte van seluitbreiding vir 'n gegewe sel en vir dogterselle by deling) en met kaarte van groeianisotropie, wat die rigting van seluitbreiding meet (ook hier gebruik vir 'n gegewe sel en vir dogterselle by deling; Fig. 5a,b, sien Metodes en Aanvullende Metodes). Ons kaarte van SAM-seloppervlakgroeitempo is in ooreenstemming met vorige waarnemings38,39, met minimale groeitempo's by die grens en maksimale groeitempo's in ontwikkelende blomme (Fig. 5a). Hoofkomponentanalise (PCA) het getoon dat GA-seinaktiwiteit negatief gekorreleer was met seloppervlakgroeiintensiteit (Figuur 5c). Ons het ook getoon dat die hoofasse van variasie, insluitend GA-seininvoer en groeiintensiteit, ortogonaal was tot die rigting wat deur hoë CLV3-uitdrukking bepaal word, wat die uitsluiting van selle van die SAM-sentrum in die oorblywende ontledings bevestig. Spearman-korrelasie-analise het die PCA-resultate bevestig (Figuur 5d), wat aandui dat hoër GA-seine in die IPR nie tot hoër seluitbreiding gelei het nie. Korrelasie-analise het egter 'n effense positiewe korrelasie tussen GA-seinaktiwiteit en groeianisotropie getoon (Figuur 5c, d), wat daarop dui dat hoër GA-sein in die IPR die rigting van selgroei en moontlik die posisie van die seldelingsvlak beïnvloed.
a, b Hittekaarte van gemiddelde oppervlakgroei (a) en groeianisotropie (b) in SAM gemiddeld oor sewe onafhanklike plante (onderskeidelik gebruik as plaasvervangers vir die sterkte en rigting van seluitbreiding). c PCA-analise het die volgende veranderlikes ingesluit: GA-sein, oppervlakgroei-intensiteit, oppervlakgroei-anisotropie en CLV3-uitdrukking. PCA-komponent 1 was hoofsaaklik negatief gekorreleer met oppervlakgroei-intensiteit en positief gekorreleer met GA-sein. PCA-komponent 2 was hoofsaaklik positief gekorreleer met oppervlakgroei-anisotropie en negatief gekorreleer met CLV3-uitdrukking. Persentasies verteenwoordig die variasie wat deur elke komponent verklaar word. d Spearman-korrelasie-analise tussen GA-sein, oppervlakgroei-intensiteit en oppervlakgroei-anisotropie op die weefselskaal, uitgesluit CZ. Die getal aan die regterkant is die Spearman rho-waarde tussen twee veranderlikes. Sterretjies dui gevalle aan waar die korrelasie/negatiewe korrelasie hoogs beduidend is. e 3D-visualisering van Col-0 SAM L1-selle deur konfokale mikroskopie. Nuwe selwande wat in die SAM (maar nie die primordium nie) na 10 uur gevorm is, word gekleur volgens hul hoekwaardes. Die kleurbalk word in die onderste regterhoek getoon. Die insetsel toon die ooreenstemmende 3D-beeld by 0 h. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. f Boksgrafieke toon selverdelingstempo's in IPR en nie-IPR Col-0 SAM (n = 10 onafhanklike plante). Die middellyn toon die mediaan, en die boksgrense dui die 25ste en 75ste persentiele aan. Snorre dui die minimum en maksimum waardes aan wat met R-sagteware bepaal is. P-waardes is verkry met Welch se tweesydige t-toets. g, h Skematiese diagram wat (g) toon hoe om die hoek van die nuwe selwand (magenta) te meet met betrekking tot die radiale rigting vanaf die middelpunt van die SAM (wit stippellyn) (slegs skerphoekwaardes, d.w.s. 0–90°, word oorweeg), en (h) die omtrek-/laterale en radiale rigtings binne die meristeem. i Frekwensiehistogramme van selverdelingsvlakoriëntasie oor die SAM (donkerblou), IPR (mediumblou) en nie-IPR (ligblou), onderskeidelik. P-waardes is verkry deur 'n tweesydige Kolmogorov-Smirnov-toets. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. j Frekwensiehistogramme van seldelingsvlakoriëntasie van die IPR rondom P3 (liggroen), P4 (mediumgroen) en P5 (donkergroen), onderskeidelik. P-waardes is verkry deur 'n tweesydige Kolmogorov-Smirnov-toets. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate.
Daarom het ons vervolgens die korrelasie tussen GA-seintransduksie en seldelingsaktiwiteit ondersoek deur nuutgevormde selwande tydens die toets te identifiseer (Fig. 5e). Hierdie benadering het ons toegelaat om die frekwensie en rigting van seldeling te meet. Verrassend genoeg het ons gevind dat die frekwensie van seldelings in die IPR en die res van die SAM (nie-IPR, Fig. 5f) soortgelyk was, wat aandui dat verskille in GA-seintransduksie tussen IPR- en nie-IPR-selle nie seldeling beduidend beïnvloed nie. Dit, en die positiewe korrelasie tussen GA-seintransduksie en groeianisotropie, het ons aangespoor om te oorweeg of GA-seintransduksieaktiwiteit die oriëntasie van die seldelingsvlak kan beïnvloed. Ons het die oriëntasie van die nuwe selwand gemeet as 'n skerphoek relatief tot die radiale as wat die meristeemsentrum en die middelpunt van die nuwe selwand verbind (Fig. 5e-i) en 'n duidelike neiging waargeneem vir selle om te verdeel teen hoeke naby 90° relatief tot die radiale as, met die hoogste frekwensies waargeneem by 70–80° (23.28%) en 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), wat ooreenstem met seldelings in die omtrek-/dwarsrigting (Fig. 5h). Om die bydrae van GA-seintransmissie tot hierdie seldelingsgedrag te ondersoek, het ons seldelingsparameters in die IPR en nie-IPR afsonderlik geanaliseer (Fig. 5i). Ons het waargeneem dat die verdeelhoekverspreiding in IPR-selle verskil van dié in nie-IPR-selle of in selle in die hele SAM, met IPR-selle wat 'n hoër proporsie laterale/sirkelvormige seldelings vertoon, d.w.s. 70–80° en 80–90° (onderskeidelik 33,86% en 30,71%, ooreenstemmende proporsies) (Fig. 5i). Dus het ons waarnemings 'n assosiasie getoon tussen hoë GA-seintransduksie en 'n seldelingsvlakoriëntasie naby die omtrekrigting, soortgelyk aan die korrelasie tussen GA-seintransduksieaktiwiteit en groeianisotropie (Fig. 5c, d). Om die ruimtelike bewaring van hierdie assosiasie verder te vestig, het ons die verdeelvlakoriëntasie in IPR-selle rondom die primordium gemeet vanaf P3, aangesien die hoogste GA-seintransduksieaktiwiteit in hierdie streek waargeneem is vanaf P4 (Fig. 4). Die verdeelhoeke van die IPR rondom P3 en P4 het geen statisties beduidende verskille getoon nie, alhoewel 'n verhoogde frekwensie van laterale seldelings waargeneem is in die IPR rondom P4 (Fig. 5j). In die IPR-selle rondom P5 het die verskil in die oriëntasie van die seldelingsvlak egter statisties beduidend geword, met 'n skerp toename in die frekwensie van transversale seldelings (Fig. 5j). Saam dui hierdie resultate daarop dat GA-seintransduksie die oriëntasie van seldelings in die SAM kan beheer, wat ooreenstem met vorige verslae40,41 dat hoë GA-seintransduksie laterale oriëntasie van seldelings in die IPR kan veroorsaak.
Daar word voorspel dat selle in die IPR nie in primordia opgeneem sal word nie, maar eerder in internodes2,42,43. Die transversale oriëntasie van seldelings in die IPR kan lei tot die tipiese organisasie van parallelle longitudinale rye epidermale selle in internodes. Ons waarnemings hierbo beskryf dui daarop dat GA-seintransduksie waarskynlik 'n rol in hierdie proses speel deur die rigting van seldeling te reguleer.
Verlies aan funksie van verskeie DELLA-gene lei tot 'n konstitutiewe GA-respons, en della-mutante kan gebruik word om hierdie hipotese te toets44. Ons het eers die uitdrukkingspatrone van vyf DELLA-gene in die SAM geanaliseer. Transkripsionele fusie van die GUS-lyn45 het aan die lig gebring dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (in 'n baie mindere mate) in die SAM uitgedruk is (Aanvullende Fig. 11a-d). In situ-hibridisasie het verder gedemonstreer dat GAI mRNA spesifiek in primordia en ontwikkelende blomme ophoop (Aanvullende Fig. 11e). RGL1- en RGL3-mRNA is dwarsdeur die SAM-kroon en in ouer blomme opgespoor, terwyl RGL2-mRNA meer volop in die grensgebied was (Aanvullende Fig. 11f-h). Konfokale beeldvorming van pRGL3::RGL3-GFP SAM het die uitdrukking wat deur in situ-hibridisasie waargeneem is, bevestig en getoon dat RGL3-proteïen in die sentrale deel van die SAM ophoop (Aanvullende Fig. 11i). Deur die pRGA::GFP-RGA-lyn te gebruik, het ons ook gevind dat RGA-proteïen in die SAM ophoop, maar die oorvloed daarvan neem af by die grens vanaf P4 (Aanvullende Fig. 11j). Dit is opmerklik dat die uitdrukkingspatrone van RGL3 en RGA ooreenstem met hoër GA-seinaktiwiteit in die IPR, soos waargeneem deur qmRGA (Fig. 4). Verder dui hierdie data daarop dat alle DELLA's in die SAM uitgedruk word en dat hul uitdrukking gesamentlik die hele SAM omspan.
Ons het vervolgens die seldelingsparameters in die wildetipe SAM (Ler, kontrole) en die gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della kwintuple (globale) mutante geanaliseer (Fig. 6a, b). Interessant genoeg het ons 'n statisties beduidende verskuiwing in die verspreiding van seldelingshoekfrekwensies in die della globale mutant SAM waargeneem in vergelyking met die wildetipe (Fig. 6c). Hierdie verandering in die della globale mutant was te wyte aan 'n toename in die frekwensie van 80–90° hoeke (34.71% vs. 24.55%) en, in 'n mindere mate, 70–80° hoeke (23.78% vs. 20.18%), d.w.s., wat ooreenstem met transversale seldelings (Fig. 6c). Die frekwensie van nie-transversale delings (0–60°) was ook laer in die della globale mutant (Fig. 6c). Die frekwensie van transversale seldelings was beduidend verhoog in die SAM van die della globale mutant (Fig. 6b). Die frekwensie van transversale seldelings in die IPR was ook hoër in die della globale mutant in vergelyking met die wilde tipe (Fig. 6d). Buite die IPR-streek het die wilde tipe 'n meer eenvormige verspreiding van seldelingshoeke gehad, terwyl die della globale mutant tangensiële delings soos die IPR verkies het (Fig. 6e). Ons het ook die oriëntasie van seldelings in die SAM van ga2 oksidase (ga2ox) vyfvoudige mutante (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, en ga2ox6-2) gekwantifiseer, 'n GA-onaktiewe mutant agtergrond waarin GA ophoop. In ooreenstemming met die toename in GA-vlakke, was die SAM van die vyfvoudige ga2ox-mutantbloeiwyse groter as dié van Col-0 (Aanvullende Fig. 12a, b), en in vergelyking met Col-0 het die vyfvoudige ga2ox SAM 'n duidelik verskillende verspreiding van selverdelingshoeke getoon, met die hoekfrekwensie wat van 50° tot 90° toeneem, d.w.s. weer tangensiële verdelings bevoordeel (Aanvullende Fig. 12a-c). Dus toon ons dat konstitutiewe aktivering van GA-seintransduksie en GA-akkumulasie laterale seldelings in die IPR en die res van die SAM veroorsaak.
a, b 3D-visualisering van die L1-laag van PI-gekleurde Ler (a) en globale della-mutant (b) SAM met behulp van konfokale mikroskopie. Nuwe selwande wat oor 'n tydperk van 10 uur in die SAM (maar nie die primordium nie) gevorm is, word getoon en gekleur volgens hul hoekwaardes. Die insetsel toon die SAM teen 0 uur. Die kleurbalk word in die onderste regterhoek vertoon. Die pyltjie in (b) wys na 'n voorbeeld van gerigte sellêers in die globale della-mutant. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. ce-vergelyking van die frekwensieverspreiding van seldelingsvlakoriëntasies in die hele SAM (d), IPR (e) en nie-IPR (f) tussen Ler en globale della. P-waardes is verkry met behulp van 'n tweesydige Kolmogorov-Smirnov-toets. f, g 3D-visualisering van konfokale beelde van PI-gekleurde SAM van Col-0 (i) en pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeniese plante. Panele (a, b) toon nuwe selwande (maar nie primordia nie) wat binne 10 uur in die SAM gevorm is. Die eksperiment is twee keer herhaal met soortgelyke resultate. h–j Vergelyking van die frekwensieverspreiding van seldelingsvlak-oriëntasies in die hele SAM (h), IPR (i) en nie-IPR (j) tussen Col-0 en pCUC2::gai-1-VENUS plante. P-waardes is verkry met behulp van 'n tweesydige Kolmogorov–Smirnov-toets.
Ons het vervolgens die effek van die inhibering van GA-seintransduksie spesifiek in die IPR getoets. Vir hierdie doel het ons die saadlobbekoppie 2 (CUC2) promotor gebruik om die uitdrukking van 'n dominante negatiewe gai-1 proteïen wat met VENUS gefuseer is (in die pCUC2::gai-1-VENUS lyn) aan te dryf. In die wilde-tipe SAM dryf die CUC2 promotor die uitdrukking van die meeste IPR's in die SAM, insluitend grensselle, vanaf P4 en verder, en soortgelyke spesifieke uitdrukking is waargeneem in pCUC2::gai-1-VENUS plante (sien hieronder). Die verspreiding van selverdelingshoeke oor die SAM of IPR van pCUC2::gai-1-VENUS plante was nie beduidend anders as dié van die wilde tipe nie, hoewel ons onverwags gevind het dat selle sonder 'n IPR in hierdie plante teen 'n hoër frekwensie van 80-90° verdeel het (Fig. 6f-j).
Daar is voorgestel dat die rigting van seldeling afhang van die geometrie van die SAM, veral die trekspanning wat deur die weefselkromming gegenereer word46. Ons het dus gevra of die vorm van die SAM verander is in die della globale mutant en pCUC2::gai-1-VENUS plante. Soos voorheen gerapporteer12, was die grootte van die della globale mutant SAM groter as dié van die wilde tipe (Aanvullende Fig. 13a, b, d). In situ hibridisasie van CLV3 en STM RNA het die meristeemuitbreiding in della mutante bevestig en verder die laterale uitbreiding van die stamselnis getoon (Aanvullende Fig. 13e, f, h, i). Die SAM-kromming was egter soortgelyk in beide genotipes (Aanvullende Fig. 13k, m, n, p). Ons het 'n soortgelyke toename in grootte in die gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della viervoudige mutant waargeneem sonder 'n verandering in kromming in vergelyking met die wilde tipe (Aanvullende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Die frekwensie van seldelingsoriëntasie is ook beïnvloed in die della-kwadruplemutant, maar in 'n mindere mate as in die della-monolitiese mutant (Aanvullende Fig. 12d-f). Hierdie dosiseffek, tesame met die gebrek aan 'n effek op kromming, dui daarop dat oorblywende RGL3-aktiwiteit in die Della-kwadruplemutant veranderinge in seldelingsoriëntasie wat veroorsaak word deur die verlies van DELLA-aktiwiteit, beperk en dat veranderinge in laterale seldelings plaasvind in reaksie op veranderinge in GA-seinaktiwiteit eerder as veranderinge in SAM-geometrie. Soos hierbo beskryf, dryf die CUC2-promotor IPR-uitdrukking in die SAM vanaf P4 (Aanvullende Fig. 14a, b), en in teenstelling hiermee het die pCUC2::gai-1-VENUS SAM 'n verminderde grootte maar hoër kromming gehad (Aanvullende Fig. 14c-h). Hierdie verandering in pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologie kan lei tot 'n ander verspreiding van meganiese spanning in vergelyking met die wilde tipe, waarin hoë omtrekspannings op 'n korter afstand van die SAM-sentrum begin47. Alternatiewelik kan die veranderinge in pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologie voortspruit uit veranderinge in streeksmeganiese eienskappe wat deur transgeen-ekspressie48 geïnduseer word. In beide gevalle kan dit die effekte van veranderinge in GA-seintransmissie gedeeltelik verreken deur die waarskynlikheid te verhoog dat selle in die omtrek-/transversale oriëntasie sal verdeel, wat ons waarnemings verklaar.
Saamgevat bevestig ons data dat hoër GA-seintransduksie 'n aktiewe rol speel in die laterale oriëntasie van die seldelingsvlak in die IPR. Dit toon ook dat meristeemkromming ook die oriëntasie van die seldelingsvlak in die IPR beïnvloed.
Die transversale oriëntasie van die verdeelvlak in die IPR, as gevolg van hoë GA-seintransduksieaktiwiteit, dui daarop dat GA 'n radiale sellêer in die epidermis binne die SAM vooraf organiseer om die sellulêre organisasie te definieer wat later in die epidermale internode gevind sal word. Sulke sellêers was inderdaad gereeld sigbaar in SAM-beelde van della globale mutante (Fig. 6b). Om dus die ontwikkelingsfunksie van die ruimtelike patroon van GA-seintransduksie in die SAM verder te ondersoek, het ons tydverloopbeelding gebruik om die ruimtelike organisasie van selle in die IPR in wildetipe (Ler en Col-0), della globale mutante en pCUC2::gai-1-VENUS transgeniese plante te analiseer.
Ons het bevind dat qmRGA getoon het dat GA-seinaktiwiteit in die IPR toegeneem het vanaf P1/P2 en 'n piek bereik het by P4, en hierdie patroon het oor tyd konstant gebly (Fig. 4a–f en Aanvullende Fig. 8c–f, k). Om die ruimtelike organisasie van selle in die IPR met toenemende GA-sein te analiseer, het ons Ler IPR-selle bo en aan die kante van P4 gemerk volgens hul ontwikkelingslot wat 34 uur na die eerste waarneming geanaliseer is, d.w.s. meer as twee plastiedtye, wat ons toelaat om IPR-selle tydens primordiumontwikkeling van P1/P2 tot P4 te volg. Ons het drie verskillende kleure gebruik: geel vir daardie selle wat in die primordium naby P4 geïntegreer is, groen vir dié wat in die IPR was, en pers vir dié wat aan beide prosesse deelgeneem het (Fig. 7a–c). By t0 (0 uur) was 1–2 lae IPR-selle sigbaar voor P4 (Fig. 7a). Soos verwag, toe hierdie selle verdeel het, het hulle dit hoofsaaklik via die transversale verdeelvlak gedoen (Fig. 7a–c). Soortgelyke resultate is verkry met behulp van Col-0 SAM (met die fokus op P3, waarvan die rand soortgelyk aan P4 in Ler vou), alhoewel in hierdie genotipe die vou wat by die blomrand gevorm is, die IPR-selle vinniger versteek het (Fig. 7g–i). Dus organiseer die verdelingspatroon van IPR-selle die selle vooraf in radiale rye, soos in internodes. Die organisasie van radiale rye en die lokalisering van IPR-selle tussen opeenvolgende organe dui daarop dat hierdie selle internodale voorlopers is.
Hier het ons 'n ratiometriese GA-sein-biosensor, qmRGA, ontwikkel wat kwantitatiewe kartering van GA-sein-aktiwiteit as gevolg van gekombineerde GA- en GA-reseptorkonsentrasies moontlik maak, terwyl interferensie met endogene seinweë geminimaliseer word, en sodoende inligting oor GA-funksie op sellulêre vlak verskaf. Vir hierdie doel het ons 'n gemodifiseerde DELLA-proteïen, mRGA, gekonstrueer wat die vermoë verloor het om DELLA-interaksievennote te bind, maar steeds sensitief is vir GA-geïnduseerde proteolise. qmRGA reageer op beide eksogene en endogene veranderinge in GA-vlakke, en sy dinamiese waarnemingseienskappe maak die assessering van ruimtelike en tydelike veranderinge in GA-sein-aktiwiteit tydens ontwikkeling moontlik. qmRGA is ook 'n baie buigsame instrument, aangesien dit by verskillende weefsels aangepas kan word deur die promotor wat vir die uitdrukking daarvan gebruik word, te verander (indien nodig), en gegewe die bewaarde aard van die GA-sein-roete en die PFYRE-motief oor angiosperme, is dit waarskynlik oordraagbaar na ander spesies22. In ooreenstemming hiermee is ook getoon dat 'n ekwivalente mutasie in die rys SLR1 DELLA-proteïen (HYY497AAA) die groeionderdrukkeraktiwiteit van SLR1 onderdruk terwyl dit die GA-gemedieerde afbraak daarvan slegs effens verminder, soortgelyk aan mRGA23. Dit is opmerklik dat onlangse studies in Arabidopsis getoon het dat 'n enkele aminosuurmutasie in die PFYRE-domein (S474L) die transkripsie-aktiwiteit van RGA verander het sonder om die vermoë daarvan om met transkripsiefaktorvennote te kommunikeer, te beïnvloed. Alhoewel hierdie mutasie baie naby is aan die 3 aminosuursubstitusies wat in mRGA teenwoordig is, toon ons studies dat hierdie twee mutasies die verskillende eienskappe van DELLA verander. Alhoewel die meeste transkripsiefaktorvennote aan die LHR1- en SAW-domeine van DELLA26,51 bind, kan sommige gekonserveerde aminosure in die PFYRE-domein help om hierdie interaksies te stabiliseer.
Internodiumontwikkeling is 'n sleuteleienskap in plantargitektuur en opbrengsverbetering. qmRGA het hoër GA-seinaktiwiteit in IPR-internodiumvoorloperselle getoon. Deur kwantitatiewe beeldvorming en genetika te kombineer, het ons getoon dat GA-seinpatrone sirkelvormige/transversale seldelingsvlakke in die SAM-epidermis superponeer, wat die seldelingsorganisasie vorm wat nodig is vir internnodiumontwikkeling. Verskeie reguleerders van seldelingsvlakoriëntasie is tydens ontwikkeling geïdentifiseer52,53. Ons werk bied 'n duidelike voorbeeld van hoe GA-seinaktiwiteit hierdie sellulêre parameter reguleer. DELLA kan interaksie hê met voorvouende proteïenkomplekse41, dus kan GA-sein die seldelingsvlakoriëntasie reguleer deur kortikale mikrotubulusoriëntasie40,41,54,55 direk te beïnvloed. Ons het onverwags getoon dat in SAM die korrelaat van hoër GA-seinaktiwiteit nie selverlenging of -deling was nie, maar slegs groei-anisotropie, wat ooreenstem met 'n direkte effek van GA op die rigting van seldeling in die IPR. Ons kan egter nie uitsluit dat hierdie effek ook indirek kan wees nie, byvoorbeeld gemedieer deur GA-geïnduseerde selwandversagting56. Veranderinge in selwandeienskappe veroorsaak meganiese spanning57,58, wat ook die oriëntasie van die seldelingsvlak kan beïnvloed deur die oriëntasie van kortikale mikrotubuli39,46,59 te beïnvloed. Die gekombineerde effekte van GA-geïnduseerde meganiese spanning en direkte regulering van mikrotubuli-oriëntasie deur GA kan betrokke wees by die generering van 'n spesifieke patroon van seldelingsoriëntasie in die IPR om internodes te definieer, en verdere studies is nodig om hierdie idee te toets. Net so het vorige studies die belangrikheid van die DELLA-interaktiewe proteïene TCP14 en 15 in die beheer van internodusvorming60,61 beklemtoon en hierdie faktore kan die werking van GA saam met BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY) bemiddel, wat internodusontwikkeling reguleer en getoon is dat dit GA-seintransduksie2,62 beïnvloed. Aangesien DELLAs interaksie het met brassinosteroïed-, etileen-, jasmoniese suur- en absisiensuur (ABA) seinweë63,64 en dat hierdie hormone mikrotubuli-oriëntasie65 kan beïnvloed, kan die effekte van GA op seldelingsoriëntasie ook deur ander hormone bemiddel word.
Vroeë sitologiese studies het getoon dat beide die binneste en buitenste streke van die Arabidopsis SAM benodig word vir internodusontwikkeling2,42. Die feit dat GA aktief seldeling in die binneste weefsels12 reguleer, ondersteun 'n dubbele funksie van GA in die regulering van meristeem- en internodusgrootte in die SAM. Die patroon van gerigte seldeling word ook streng gereguleer in die binneste SAM-weefsel, en hierdie regulering is noodsaaklik vir stamgroei52. Dit sal interessant wees om te ondersoek of GA ook 'n rol speel in die oriëntasie van die seldelingsvlak in die binneste SAM-organisasie, en sodoende die spesifikasie en ontwikkeling van internodes binne die SAM sinchroniseer.
Plante is in vitro in grond of 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) aangevul met 1% sukrose en 1% agar (Sigma) onder standaardtoestande (16 uur lig, 22 °C) gekweek, behalwe vir hipokotiel- en wortelgroei-eksperimente waarin saailinge op vertikale plate onder konstante lig en 22 °C gekweek is. Vir nitraat-eksperimente is plante gekweek op gemodifiseerde MS-medium (bioWORLD-plantmedium) aangevul met voldoende nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinaat, 1% sukrose en 1% A-agar (Sigma) onder langdagtoestande.
GID1a cDNA wat in pDONR221 ingevoeg is, is met pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW herkombineer om pUBQ10::GID1a-mCherry te genereer. IDD2 DNS wat in pDONR221 ingevoeg is, is in pB7RWG266 herkombineer om p35S:IDD2-RFP te genereer. Om pGID1b::2xmTQ2-GID1b te genereer, is 'n 3.9 kb fragment stroomop van die GID1b koderingsgebied en 'n 4.7 kb fragment wat die GID1b cDNA (1.3 kb) en terminator (3.4 kb) bevat, eers geamplifiseer met behulp van die primers in Aanvullende Tabel 3 en toe onderskeidelik in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ingevoeg, en uiteindelik met pDONR221 2xmTQ268 in die pGreen 012567 teikenvektor herkombineer met behulp van Gateway-kloning. Om pCUC2::LSSmOrange te genereer, is die CUC2-promotorvolgorde (3229 bp stroomop van ATG) gevolg deur die koderingsvolgorde van groot Stokes-verskuifde mOrange (LSSmOrange)69 met die N7-kernlokaliseringssein en die NOS-transkripsieterminator in die pGreen kanamisien-teikenvektor saamgestel met behulp van die Gateway 3-fragment-rekombinasiestelsel (Invitrogen). Die plantbinêre vektor is in Agrobacterium tumefaciens-stam GV3101 ingebring en in Nicotiana benthamiana-blare ingebring deur die Agrobacterium-infiltrasiemetode en in Arabidopsis thaliana Col-0 deur die blomdoopmetode, onderskeidelik. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry en pCLV3::mCherry-NLS qmRGA is onderskeidelik uit die F3- en F1-nageslag van die onderskeie kruisings geïsoleer.
RNA in situ hibridisasie is uitgevoer op ongeveer 1 cm lange lootpunte72, wat versamel en onmiddellik gefikseer is in FAA-oplossing (3.7% formaldehied, 5% asynsuur, 50% etanol) wat vooraf afgekoel is tot 4 °C. Na 2 × 15 min vakuumbehandelings is die fikseermiddel verander en monsters oornag geïnkubeer. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, en RGL3 cDNA's en antisense probes na hul 3'-UTR'e is gesintetiseer met behulp van die primers wat in Aanvullende Tabel 3 getoon word soos beskryf deur Rosier et al.73. Digoksigenien-gemerkte probes is immunodetekteer met behulp van digoksigenien-teenliggaampies (3000-voudige verdunning; Roche, katalogusnommer: 11 093 274 910), en snitte is gekleur met 'n 5-bromo-4-chloro-3-indolielfosfaat (BCIP, 250-voudige verdunning)/nitrobloutetrasolium (NBT, 200-voudige verdunning) oplossing.
Plasingstyd: 10 Februarie 2025