In hierdie studie, die stimulerende effekte van die gekombineerde behandeling vanplantgroeireguleerders(2,4-D en kinetien) en ysteroksied-nanopartikels (Fe₃O₄-NP's) op in vitro morfogenese en sekondêre metabolietproduksie in *Hypericum perforatum* L. is ondersoek. Die geoptimaliseerde behandeling [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetien (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP's (4 mg/L)] het die plantgroeiparameters aansienlik verbeter: planthoogte het met 59.6% toegeneem, wortellengte met 114.0%, knopgetal met 180.0%, en kallus varsgewig met 198.3% in vergelyking met die kontrolegroep. Hierdie gekombineerde behandeling het ook die regenerasiedoeltreffendheid (50.85%) verbeter en die hiperisieninhoud met 66.6% verhoog. GC-MS-analise het hoë inhoud van hiperosied, β-patoleen en setielalkohol aan die lig gebring, wat 93.36% van die totale piekarea uitmaak, terwyl die inhoud van totale fenole en flavonoïede met soveel as 80.1% toegeneem het. Hierdie resultate dui daarop dat plantgroeireguleerders (PGR's) en Fe₃O₄-nanopartikels (Fe₃O₄-NP's) 'n sinergistiese effek uitoefen deur organogenese en die ophoping van bioaktiewe verbindings te stimuleer, wat 'n belowende strategie vir die biotegnologiese verbetering van medisinale plante verteenwoordig.
Sint-Janskruid (Hypericum perforatum L.), ook bekend as Sint-Janskruid, is 'n meerjarige kruidagtige plant van die familie Hypericaceae wat ekonomiese waarde het.[1] Die potensiële bioaktiewe komponente daarvan sluit in natuurlike tanniene, xantone, floroglucinol, naftaleendiantroon (hiperien en pseudohiperien), flavonoïede, fenoliese sure en essensiële olies.[2,3,4] Sint-Janskruid kan deur tradisionele metodes gekweek word; die seisoenaliteit van tradisionele metodes, lae saadontkieming en vatbaarheid vir siektes beperk egter die potensiaal vir grootskaalse verbouing en voortdurende vorming van sekondêre metaboliete.[1,5,6]
Dus word in vitro-weefselkultuur beskou as 'n effektiewe metode vir vinnige plantvoortplanting, bewaring van kiemplasma-bronne en verhoogde opbrengs van medisinale verbindings [7, 8]. Plantgroeireguleerders (PGR's) speel 'n belangrike rol in die regulering van morfogenese en is nodig vir die in vitro-kweek van kallus en hele organismes. Optimalisering van hul konsentrasies en kombinasies is van kritieke belang vir die suksesvolle voltooiing van hierdie ontwikkelingsprosesse [9]. Daarom is dit belangrik om die toepaslike samestelling en konsentrasie van reguleerders te verstaan om die groei en regeneratiewe kapasiteit van Sint-Janskruid (H. perforatum) te verbeter [10].
Ysteroksied-nanopartikels (Fe₃O₄) is 'n klas nanopartikels wat vir weefselkultuur ontwikkel is of word. Fe₃O₄ het beduidende magnetiese eienskappe, goeie bioversoenbaarheid en die vermoë om plantgroei te bevorder en omgewingsstres te verminder, daarom het dit aansienlike aandag in weefselkultuurontwerpe getrek. Potensiële toepassings van hierdie nanopartikels kan die optimalisering van in vitro-kultuur insluit om seldeling te bevorder, voedingstofopname te verbeter en antioksidantensieme te aktiveer [11].
Alhoewel nanopartikels goeie bevorderende effekte op plantgroei getoon het, bly studies oor die gekombineerde toediening van Fe₃O₄ nanopartikels en geoptimaliseerde plantgroeireguleerders in *H. perforatum* skaars. Om hierdie kennisgaping te vul, het hierdie studie die effekte van hul gekombineerde effekte op in vitro morfogenese en sekondêre metabolietproduksie geëvalueer om nuwe insigte te verskaf vir die verbetering van die eienskappe van medisinale plante. Daarom het hierdie studie twee doelwitte: (1) optimaliseer die konsentrasie van plantgroeireguleerders om kallusvorming, lootregenerasie en wortelvorming in vitro effektief te bevorder; en (2) evalueer die effekte van Fe₃O₄ nanopartikels op groeiparameters in vitro. Toekomstige planne sluit in die evaluering van die oorlewingsyfer van geregenereerde plante tydens akklimatisering (in vitro). Daar word verwag dat die resultate van hierdie studie die mikropropagasie-effektiwiteit van *H. perforatum* aansienlik sal verbeter, en sodoende bydra tot die volhoubare gebruik en biotegnologiese toepassings van hierdie belangrike medisinale plant.
In hierdie studie het ons blaareksplante verkry van eenjarige Sint-Janskruidplante (moederplante) wat in die veld gekweek is. Hierdie eksplante is gebruik om in vitro-kweektoestande te optimaliseer. Voor kweek is die blare deeglik vir 'n paar minute onder lopende gedistilleerde water afgespoel. Die eksplantoppervlaktes is toe ontsmet deur onderdompeling in 70% etanol vir 30 sekondes, gevolg deur onderdompeling in 'n 1.5% natriumhipochloriet (NaOCl) oplossing wat 'n paar druppels Tween 20 bevat vir 10 minute. Laastens is die eksplante drie keer met steriele gedistilleerde water afgespoel voordat hulle na die volgende kweekmedium oorgedra is.
Oor die volgende vier weke is lootregenerasieparameters gemeet, insluitend regenerasietempo, lootgetal per eksplantaat en lootlengte. Wanneer geregenereerde lote 'n lengte van minstens 2 cm bereik het, is hulle oorgedra na 'n wortelmedium wat bestaan uit halfsterkte MS-medium, 0.5 mg/L indoolbottersuur (IBA) en 0.3% guargom. Wortelkultuur het vir drie weke voortgeduur, waartydens die worteltempo, wortelgetal en wortellengte gemeet is. Elke behandeling is drie keer herhaal, met 10 eksplante per herhaling gekweek, wat ongeveer 30 eksplante per behandeling opgelewer het.
Planthoogte is in sentimeter (cm) gemeet met behulp van 'n liniaal, vanaf die basis van die plant tot die punt van die hoogste blaar. Wortellengte is in millimeter (mm) gemeet onmiddellik nadat die saailinge versigtig verwyder is en die groeimedium verwyder is. Die aantal knoppe per eksplantaat is direk op elke plant getel. Die aantal swart kolle op die blare, bekend as nodules, is visueel gemeet. Daar word geglo dat hierdie swart nodules kliere is wat hiperisien, of oksidatiewe kolle, bevat en word gebruik as 'n fisiologiese aanduiding van die plant se reaksie op behandeling. Nadat al die groeimedium verwyder is, is die vars gewig van die saailinge gemeet met behulp van 'n elektroniese skaal met 'n akkuraatheid van milligram (mg).
Die metode vir die berekening van die tempo van kallusvorming is soos volg: nadat eksplantate vir vier weke in 'n medium gekweek is wat verskeie groeireguleerders (kinases, 2,4-D en Fe3O4) bevat, word die aantal eksplantate wat kallus kan vorm, getel. Die formule vir die berekening van die tempo van kallusvorming is soos volg:
Elke behandeling is drie keer herhaal, met ten minste 10 eksplantate wat in elke herhaling ondersoek is.
Die regenerasietempo weerspieël die proporsie kallusweefsel wat die knopdifferensiasieproses suksesvol voltooi na die kallusvormingsfase. Hierdie aanwyser demonstreer die vermoë van kallusweefsel om in gedifferensieerde weefsel te transformeer en in nuwe plantorgane te groei.
Die bewortelingskoëffisiënt is die verhouding van die aantal takke wat in staat is om te wortel tot die totale aantal takke. Hierdie aanwyser weerspieël die sukses van die bewortelingstadium, wat noodsaaklik is in mikrovoortplanting en plantvoortplanting, aangesien goeie beworteling saailinge help om beter te oorleef in groeitoestande.
Hiperisienverbindings is met 90% metanol geëkstraheer. Vyftig mg gedroogde plantmateriaal is by 1 ml metanol gevoeg en vir 20 minute teen 30 kHz in 'n ultrasoniese skoonmaker (model A5120-3YJ) by kamertemperatuur in die donker gesonikeer. Na sonikering is die monster vir 15 minute teen 6000 rpm gesentrifugeer. Die supernatant is versamel, en die absorbansie van hiperisien is by 592 nm gemeet met behulp van 'n Plus-3000 S spektrofotometer volgens die metode wat deur Conceiçao et al. beskryf is [14].
Die meeste behandelings met plantgroeireguleerders (PGR's) en ysteroksied-nanopartikels (Fe₃O₄-NP's) het nie swart nodule-vorming op geregenereerde lootblare veroorsaak nie. Geen nodules is waargeneem in enige van die behandelings met 0.5 of 1 mg/L 2,4-D, 0.5 of 1 mg/L kinetien, of 1, 2, of 4 mg/L ysteroksied-nanopartikels nie. 'n Paar kombinasies het 'n effense toename in nodule-ontwikkeling getoon (maar nie statisties beduidend nie) by hoër konsentrasies van kinetien en/of ysteroksied-nanopartikels, soos die kombinasie van 2,4-D (0.5–2 mg/L) met kinetien (1–1.5 mg/L) en ysteroksied-nanopartikels (2–4 mg/L). Hierdie resultate word in Figuur 2 getoon. Swart nodules verteenwoordig hiperisienryke kliere, beide natuurlik voorkomend en voordelig. In hierdie studie is swart nodules hoofsaaklik geassosieer met die verbruining van weefsels, wat dui op 'n gunstige omgewing vir hiperisien-akkumulasie. Behandeling met 2,4-D, kinetien en Fe₃O₄ nanopartikels het kallusgroei bevorder, verbruining verminder en chlorofilinhoud verhoog, wat dui op verbeterde metaboliese funksie en potensiële vermindering van oksidatiewe skade [37]. Hierdie studie het die effekte van kinetien in kombinasie met 2,4-D en Fe₃O₄ nanopartikels op die groei en ontwikkeling van Sint-Janskruid-kallus geëvalueer (Fig. 3a-g). Vorige studies het getoon dat Fe₃O₄ nanopartikels antifungale en antimikrobiese aktiwiteite het [38, 39] en, wanneer dit in kombinasie met plantgroeireguleerders gebruik word, plantverdedigingsmeganismes kan stimuleer en sellulêre stresindekse kan verminder [18]. Alhoewel die biosintese van sekondêre metaboliete geneties gereguleer word, is hul werklike opbrengs hoogs afhanklik van omgewingstoestande. Metaboliese en morfologiese veranderinge kan sekondêre metabolietvlakke beïnvloed deur die uitdrukking van spesifieke plantgene te reguleer en op omgewingsfaktore te reageer. Verder kan induseerders die aktivering van nuwe gene veroorsaak, wat weer ensiematiese aktiwiteit stimuleer, wat uiteindelik verskeie biosintetiese weë aktiveer en lei tot die vorming van sekondêre metaboliete. Verder het 'n ander studie getoon dat die vermindering van skadu die blootstelling aan sonlig verhoog, wat die dagtemperature in die natuurlike habitat van *Hypericum perforatum* verhoog, wat ook bydra tot verhoogde hiperisienopbrengs. Gebaseer op hierdie data het hierdie studie die rol van yster-nanopartikels as potensiële induseerders in weefselkultuur ondersoek. Die resultate het getoon dat hierdie nanopartikels gene wat betrokke is by hesperidienbiosintese deur ensiematiese stimulasie kan aktiveer, wat lei tot verhoogde ophoping van hierdie verbinding (Fig. 2). Daarom kan daar, in vergelyking met plante wat onder natuurlike toestande groei, aangevoer word dat die produksie van sulke verbindings in vivo ook verbeter kan word wanneer matige stres gekombineer word met die aktivering van gene wat betrokke is by die biosintese van sekondêre metaboliete. Kombinasiebehandelings het oor die algemeen 'n positiewe effek op die regenerasietempo, maar in sommige gevalle word hierdie effek verswak. Dit is opmerklik dat behandeling met 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinase, en verskillende konsentrasies die regenerasietempo onafhanklik en beduidend met 50.85% kan verhoog in vergelyking met die kontrolegroep (Fig. 4c). Hierdie resultate dui daarop dat spesifieke kombinasies van nanohormone sinergisties kan optree om plantgroei en metabolietproduksie te bevorder, wat van groot belang is vir weefselkultuur van medisinale plante. Palmer en Keller [50] het getoon dat 2,4-D-behandeling onafhanklik kallusvorming in St. perforatum kan veroorsaak, terwyl die byvoeging van kinase kallusvorming en regenerasie aansienlik verbeter het. Hierdie effek was te wyte aan die verbetering van hormonale balans en stimulasie van seldeling. Bal et al. [51] het bevind dat Fe₃O₄-NP-behandeling onafhanklik die funksie van antioksidantensieme kan verbeter, waardeur wortelgroei in St. perforatum bevorder word. Kultuurmedia wat Fe₃O₄-nanopartikels bevat teen konsentrasies van 0.5 mg/L, 1 mg/L en 1.5 mg/L het die regenerasietempo van vlasplante verbeter [52]. Die gebruik van kinetien, 2,4-dichloorbensotiazolinoon, en Fe₃O₄ nanopartikels het die kallus- en wortelvormingstempo's aansienlik verbeter, maar die potensiële newe-effekte van die gebruik van hierdie hormone vir in vitro-regenerasie moet in ag geneem word. Langtermyn- of hoë-konsentrasie gebruik van 2,4-dichloorbensotiazolinoon of kinetien kan byvoorbeeld lei tot somatiese klonale variasie, oksidatiewe stres, abnormale kallusmorfologie of vitrifikasie. Daarom voorspel 'n hoë regenerasietempo nie noodwendig genetiese stabiliteit nie. Alle geregenereerde plante moet beoordeel word met behulp van molekulêre merkers (bv. RAPD, ISSR, AFLP) of sitogenetiese analise om hul homogeniteit en ooreenkoms met in vivo plante te bepaal [53,54,55].
Hierdie studie het vir die eerste keer gedemonstreer dat die gekombineerde gebruik van plantgroeireguleerders (2,4-D en kinetien) met Fe₃O₄ nanopartikels morfogenese en die ophoping van sleutel bioaktiewe metaboliete (insluitend hiperisien en hiperosied) in *Hypericum perforatum* kan verbeter. Die geoptimaliseerde behandelingsregime (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetien + 4 mg/L Fe₃O₄-NP's) het nie net kallusvorming, organogenese en sekondêre metabolietopbrengs gemaksimeer nie, maar het ook 'n ligte induserende effek gedemonstreer, wat die plant se stresverdraagsaamheid en medisinale waarde moontlik kan verbeter. Die kombinasie van nanotegnologie en plantweefselkultuur bied 'n volhoubare en doeltreffende platform vir grootskaalse in vitro-produksie van medisinale verbindings. Hierdie resultate baan die weg vir industriële toepassings en toekomstige navorsing oor molekulêre meganismes, dosisoptimalisering en genetiese presisie, waardeur fundamentele navorsing oor medisinale plante met praktiese biotegnologie gekoppel word.
Plasingstyd: 12 Desember 2025