Die wurmmiddel N,N-diëtiel-m-toluamied (DEET) is gerapporteer om AChE (asetielcholinesterase) te inhibeer en het potensiële karsinogene eienskappe as gevolg van oormatige vaskularisasie. In hierdie artikel wys ons dat DEET spesifiek endoteelselle stimuleer wat angiogenese bevorder, en sodoende tumorgroei verhoog. DEET aktiveer sellulêre prosesse wat lei tot angiogenese, insluitend proliferasie, migrasie en adhesie. Dit word geassosieer met verhoogde NO-produksie en VEGF-uitdrukking in endoteelselle. Die stilte van M3 of die gebruik van farmakologiese M3-inhibeerders het al hierdie effekte afgeskaf, wat daarop dui dat DEET-geïnduseerde angiogenese M3-sensitief is. Eksperimente wat kalsiumsein in endoteel- en HEK-selle behels wat M3-reseptore ooruitdruk, sowel as bindings- en koppelstudies, dui aan dat DEET as 'n allosteriese modulator van M3-reseptore optree. Verder inhibeer DEET AChE, waardeur die biobeskikbaarheid van asetielcholien en die binding daarvan aan M3-reseptore verhoog word, en proangiogeniese effekte deur allosteriese regulering verbeter word.
Primêre EC's is uit die aorta van Switserse muise geïsoleer. Die ekstraksiemetode is aangepas vanaf die Kobayashi-protokol 26. Muur EC's is gekweek in EBM-2 medium aangevul met 5% hitte-geïnaktiveerde FBS tot die vierde deurgang.
Die effek van twee konsentrasies DEET op die proliferasie van HUVEC, U87MG of BF16F10 is geanaliseer met behulp van die CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kortliks, 5.103 selle per putjie is in 'n 96-putjie-plaat gesaai, oornag toegelaat om te heg, en dan vir 24 uur met DEET behandel. Nadat die groeimedium verwyder is, voeg kleurstofbindingsoplossing by elke putjie van die mikroplaat en inkubeer die selle vir 30 minute by 37 °C. Fluoresensievlakke is bepaal met behulp van 'n Mithras LB940 multimodus-mikroplaatleser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland) toegerus met 485 nm-opwekkingsfilters en 530 nm-emissiefilters.
HUVEC is gesaai in 96-put plate teen 'n digtheid van 104 selle per put. Selle is vir 24 uur met DEET behandel. Sellewensvatbaarheid is beoordeel met behulp van 'n kolorimetriese MTT-toets (Sigma-Aldrich, M5655). Optiese digtheidwaardes is verkry op 'n multimodus mikroplaatleser (Mithras LB940) by 'n golflengte van 570 nm.
Die effekte van DEET is bestudeer deur gebruik te maak van in vitro angiogenese toetse. Behandeling met 10-8 M of 10-5 M DEET het die vorming van kapillêre lengte in HUVEC's verhoog (Fig. 1a, b, wit stawe). In vergelyking met die kontrolegroep, het behandeling met DEET-konsentrasies wat wissel van 10-14 tot 10-5 M getoon dat die kapillêre lengte 'n plato bereik het by 10-8 M DEET (Aanvullende Fig. S2). Geen betekenisvolle verskil is gevind in die in vitro proangiogeniese effek van HUVEC's wat met DEET behandel is in die konsentrasiereeks van 10-8 M en 10-5 M nie.
Om die effek van DEET op neovaskularisasie te bepaal, het ons in vivo neovaskularisasie studies uitgevoer. Na 14 dae het muise wat ingespuit is met endoteelselle wat vooraf gekweek is met 10-8 M of 10-5 M DEET 'n beduidende toename in hemoglobieninhoud getoon (Fig. 1c, wit stawe).
Verder is DEET-geïnduseerde neovaskularisasie bestudeer in U87MG xenotransplantaat-draende muise wat daagliks (ip) met DEET ingespuit is teen 'n dosis wat bekend is om plasmakonsentrasies van 10-5 M te induseer, wat normaal is in blootgestelde mense. in 23. Opspoorbare gewasse (dws gewasse >100 mm3) is 14 dae na inspuiting van U87MG-selle in muise waargeneem. Op dag 28 was tumorgroei aansienlik verbeter in DEET-behandelde muise in vergelyking met kontrolemuise (Fig. 1d, vierkante). Verder het CD31-kleuring van gewasse getoon dat DEET die kapillêre area aansienlik verhoog het, maar nie mikrovatdigtheid nie. (Fig. 1e–g).
Om die rol van muskariene reseptore in DETA-geïnduseerde proliferasie te bepaal, is 10-8 M of 10-5 M DETA in die teenwoordigheid van pFHHSiD (10-7 M, 'n selektiewe M3 reseptor antagonis) gebruik. Behandeling van HUVEC. pFHHSiD het die proliferatiewe eienskappe van DETA by alle konsentrasies heeltemal geblokkeer (Tabel 1).
Onder hierdie toestande het ons ook ondersoek of DEET kapillêre lengte in HUVEC-selle sal verhoog. Net so het pFHHSiD DEET-geïnduseerde kapillêre lengte aansienlik verhoed (Fig. 1a, b, grys stawe). Verder is soortgelyke eksperimente uitgevoer met M3 siRNA. Alhoewel die kontrole siRNA nie effektief was in die bevordering van kapillêre vorming nie, het stilmaking van die M3 muskariniese reseptor die vermoë van DEET om kapillêre lengte te verhoog afgeskaf (Fig. 1a, b, swart stawe).
Verder is beide 10-8 M of 10-5 M DEET-geïnduseerde vaskularisasie in vitro en neovaskularisasie in vivo heeltemal geblokkeer deur pFHHSiD (Fig. 1c, d, sirkels). Hierdie resultate dui aan dat DEET angiogenese bevorder deur 'n pad wat sensitief is vir selektiewe M3 reseptor antagoniste of M3 siRNA.
AChE is die molekulêre teiken van DEET. Middels soos donepezil, wat as AChE-inhibeerders optree, kan EC angiogenese in vitro en in muis-agterledemaat-iskemie-modelle stimuleer14. Ons het die effek van twee konsentrasies DEET op AChE-ensiemaktiwiteit in HUVEC getoets. Lae (10-8 M) en hoë (10-5 M) konsentrasies van DEET het endoteel AChE aktiwiteit verlaag in vergelyking met kontrole toestande (Fig. 2).
Beide konsentrasies van DEET (10-8 M en 10-5 M) het asetielcholinesterase-aktiwiteit op HUVEC verminder. BW284c51 (10-5 M) is gebruik as 'n kontrole vir asetielcholienesterase inhibeerders. Resultate word uitgedruk as persentasie van AChE-aktiwiteit op HUVEC behandel met die twee konsentrasies van DEET in vergelyking met voertuig-behandelde selle. Waardes word uitgedruk as gemiddelde ± SEM van ses onafhanklike eksperimente. *p < 0.05 in vergelyking met kontrole (Kruskal-Wallis en Dunn meervoudige vergelykingstoets).
Stikstofoksied (NO) is betrokke by die angiogeniese proses 33, daarom is GEEN produksie in DEET-gestimuleerde HUVECs bestudeer. DEET-behandelde endoteel NO-produksie is verhoog in vergelyking met kontroleselle, maar het slegs betekenis bereik teen 'n dosis van 10-8 M (Fig. 3c). Om die molekulêre veranderinge wat DEET-geïnduseerde NO-produksie beheer te bepaal, is eNOS-uitdrukking en -aktivering deur Western blotting ontleed. Alhoewel DEET-behandeling nie eNOS-uitdrukking verander het nie, het dit eNOS-fosforilering by sy aktiveerplek (Ser-1177) aansienlik verhoog terwyl dit sy inhiberende plek (Thr-495) verminder het in vergelyking met onbehandelde selle in eNOS-fosforilering (Fig. 3d). Verder is die verhouding van gefosforileerde eNOS by die aktiveringsplek en inhiberende plek bereken nadat die hoeveelheid gefosforileerde eNOS tot die totale hoeveelheid ensiem genormaliseer is. Hierdie verhouding is aansienlik verhoog in HUVECs behandel met elke konsentrasie van DEET in vergelyking met onbehandelde selle (Fig. 3d).
Laastens is die uitdrukking van VEGF, een van die hoof proangiogeniese faktore, deur Western blotting ontleed. DEET het VEGF-uitdrukking aansienlik verhoog, terwyl pFHHSiD hierdie uitdrukking heeltemal geblokkeer het.
Aangesien die effekte van DEET sensitief is vir beide farmakologiese blokkade en afregulering van M3-reseptore, het ons die hipotese getoets dat DEET kalsiumsein kan verbeter. Verbasend genoeg het DEET nie daarin geslaag om sitoplasmiese kalsium in HUVEC (data nie getoon nie) en HEK/M3 (Fig. 4a, b) te verhoog vir beide konsentrasies wat gebruik is nie.
Postyd: 30 Desember 2024