Die anthelmintiese middel N,N-diëtiel-m-toluamied (DEET) is berig om AChE (asetielcholinesterase) te inhibeer en het potensiële karsinogeniese eienskappe as gevolg van oormatige vaskularisasie. In hierdie artikel toon ons dat DEET spesifiek endoteelselle stimuleer wat angiogenese bevorder, waardeur gewasgroei verhoog word. DEET aktiveer sellulêre prosesse wat lei tot angiogenese, insluitend proliferasie, migrasie en adhesie. Dit word geassosieer met verhoogde NO-produksie en VEGF-uitdrukking in endoteelselle. Die stilmaak van M3 of die gebruik van farmakologiese M3-inhibeerders het al hierdie effekte afgeskaf, wat daarop dui dat DEET-geïnduseerde angiogenese M3-sensitief is. Eksperimente wat kalsiumseintransduksie in endoteelselle en HEK-selle behels wat M3-reseptore ooruitdruk, sowel as bindings- en dockingstudies, dui daarop dat DEET as 'n allosteriese modulator van M3-reseptore optree. Verder inhibeer DEET AChE, waardeur die biobeskikbaarheid van asetielcholien en die binding daarvan aan M3-reseptore verhoog word, en proangiogeniese effekte deur allosteriese regulering versterk word.
Primêre EC's is geïsoleer uit die aorta van Switserse muise. Die ekstraksiemetode is aangepas vanaf die Kobayashi-protokol 26. Murine EC's is gekweek in EBM-2-medium aangevul met 5% hitte-geïnaktiveerde FBS tot die vierde deurgang.
Die effek van twee konsentrasies DEET op die proliferasie van HUVEC, U87MG of BF16F10 is geanaliseer met behulp van die CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kortliks, 5.103 selle per putjie is in 'n 96-putjie-plaat gesaai, oornag toegelaat om te heg, en dan vir 24 uur met DEET behandel. Nadat die groeimedium verwyder is, voeg kleurstofbindingsoplossing by elke putjie van die mikroplaat en inkubeer die selle by 37 °C vir 30 min. Fluoresensievlakke is bepaal met behulp van 'n Mithras LB940 multimodus-mikroplaatleser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland) toegerus met 485 nm-opwekkingsfilters en 530 nm-emissiefilters.
HUVEC is in 96-putplate gesaai teen 'n digtheid van 104 selle per putjie. Selle is vir 24 uur met DEET behandel. Sellewensvatbaarheid is bepaal met behulp van 'n kolorimetriese MTT-toets (Sigma-Aldrich, M5655). Optiese digtheidswaardes is verkry op 'n multimodus-mikroplaatleser (Mithras LB940) teen 'n golflengte van 570 nm.
Die effekte van DEET is bestudeer met behulp van in vitro angiogenese-toetse. Behandeling met 10-8 M of 10-5 M DEET het die vorming van kapillêre lengte in HUVEC's verhoog (Fig. 1a, b, wit stawe). In vergelyking met die kontrolegroep, het behandeling met DEET-konsentrasies wat wissel van 10-14 tot 10-5 M getoon dat die kapillêre lengte 'n plato bereik het by 10-8 M DEET (Aanvullende Fig. S2). Geen beduidende verskil is gevind in die in vitro proangiogeniese effek van HUVEC's wat met DEET behandel is in die konsentrasiebereik van 10-8 M en 10-5 M nie.
Om die effek van DEET op neovaskularisasie te bepaal, het ons in vivo neovaskularisasiestudies uitgevoer. Na 14 dae het muise wat ingespuit is met endoteelselle wat vooraf gekweek is met 10-8 M of 10-5 M DEET 'n beduidende toename in hemoglobieninhoud getoon (Fig. 1c, wit stawe).
Verder is DEET-geïnduseerde neovaskularisasie bestudeer in U87MG xenograft-draende muise wat daagliks (ip) ingespuit is met DEET teen 'n dosis wat bekend is om plasmakonsentrasies van 10-5 M te veroorsaak, wat normaal is in blootgestelde mense. in 23. Opspoorbare gewasse (dws gewasse >100 mm3) is waargeneem 14 dae na inspuiting van U87MG-selle in muise. Op dag 28 was gewasgroei beduidend verbeter in DEET-behandelde muise in vergelyking met kontrolemuise (Fig. 1d, vierkante). Verder het CD31-kleuring van gewasse getoon dat DEET die kapillêre area beduidend verhoog het, maar nie die mikrovatdigtheid nie. (Fig. 1e-g).
Om die rol van muskariniese reseptore in DETA-geïnduseerde proliferasie te bepaal, is 10-8 M of 10-5 M DETA in die teenwoordigheid van pFHHSiD (10-7 M, 'n selektiewe M3-reseptor-antagonis) gebruik. Behandeling van HUVEC. pFHHSiD het die proliferatiewe eienskappe van DETA heeltemal geblokkeer teen alle konsentrasies (Tabel 1).
Onder hierdie toestande het ons ook ondersoek of DEET die kapillêre lengte in HUVEC-selle sou verhoog. Net so het pFHHSiD DEET-geïnduseerde kapillêre lengte beduidend voorkom (Fig. 1a, b, grys stawe). Verder is soortgelyke eksperimente met M3 siRNA uitgevoer. Alhoewel die kontrole siRNA nie effektief was in die bevordering van kapillêre vorming nie, het die stilmaak van die M3 muskariniese reseptor die vermoë van DEET om die kapillêre lengte te verhoog, afgeskaf (Fig. 1a, b, swart stawe).
Verder is beide 10-8 M of 10-5 M DEET-geïnduseerde vaskularisasie in vitro en neovaskularisasie in vivo heeltemal geblokkeer deur pFHHSiD (Fig. 1c, d, sirkels). Hierdie resultate dui daarop dat DEET angiogenese bevorder deur 'n pad wat sensitief is vir selektiewe M3-reseptor-antagoniste of M3 siRNA.
AChE is die molekulêre teiken van DEET. Middels soos donepezil, wat as AChE-inhibeerders optree, kan EC-angiogenese in vitro en in muis-agterpoot-iskemie-modelle stimuleer14. Ons het die effek van twee konsentrasies DEET op AChE-ensiemaktiwiteit in HUVEC getoets. Lae (10-8 M) en hoë (10-5 M) konsentrasies van DEET het endoteel-AChE-aktiwiteit verminder in vergelyking met kontroletoestande (Fig. 2).
Beide konsentrasies DEET (10-8 M en 10-5 M) het asetielcholinesterase-aktiwiteit op HUVEC verminder. BW284c51 (10-5 M) is as 'n kontrole vir asetielcholinesterase-inhibeerders gebruik. Resultate word uitgedruk as persentasie AChE-aktiwiteit op HUVEC behandel met die twee konsentrasies DEET in vergelyking met selle wat met 'n draer behandel is. Waardes word uitgedruk as gemiddelde ± SEM van ses onafhanklike eksperimente. *p < 0.05 in vergelyking met kontrole (Kruskal-Wallis en Dunn meervoudige vergelykingstoets).
Stikstofoksied (NO) is betrokke by die angiogeniese proses 33, daarom is NO-produksie in DEET-gestimuleerde HUVEC's bestudeer. DEET-behandelde endoteel NO-produksie is verhoog in vergelyking met kontroleselle, maar het slegs betekenisvolheid bereik teen 'n dosis van 10-8 M (Fig. 3c). Om die molekulêre veranderinge wat DEET-geïnduseerde NO-produksie beheer, te bepaal, is eNOS-ekspressie en -aktivering deur Western blotting geanaliseer. Alhoewel DEET-behandeling nie eNOS-ekspressie verander het nie, het dit eNOS-fosforilering by sy aktiveringsplek (Ser-1177) aansienlik verhoog terwyl dit sy inhiberende plek (Thr-495) verminder het in vergelyking met onbehandelde selle in eNOS-fosforilering (Fig. 3d). Verder is die verhouding van gefosforileerde eNOS by die aktiveringsplek en inhiberende plek bereken nadat die hoeveelheid gefosforileerde eNOS tot die totale hoeveelheid ensiem genormaliseer is. Hierdie verhouding was aansienlik verhoog in HUVEC's wat met elke konsentrasie DEET behandel is in vergelyking met onbehandelde selle (Fig. 3d).
Laastens is die uitdrukking van VEGF, een van die belangrikste proangiogeniese faktore, deur Western blotting geanaliseer. DEET het VEGF-uitdrukking beduidend verhoog, terwyl pFHHSiD hierdie uitdrukking heeltemal geblokkeer het.
Aangesien die effekte van DEET sensitief is vir beide farmakologiese blokkade en afregulering van M3-reseptore, het ons die hipotese getoets dat DEET kalsiumseintransduksie kan verbeter. Verbasend genoeg kon DEET nie sitoplasmiese kalsium in HUVEC (data nie getoon nie) en HEK/M3 (Fig. 4a, b) verhoog vir beide konsentrasies wat gebruik is nie.
Plasingstyd: 30 Desember 2024