Plaagdoders speel 'n kritieke rol in die aanspreek van wêreldwye voedseltekorte en die bestryding van vektorgedraagde menslike siektes. Die groeiende probleem van plaagdoderweerstand vereis egter dringend die ontdekking van nuwe verbindings wat onderbenutte teikens teiken. Insek-oorgangsreseptorpotensiaal (TRPV)-kanale - Nanzhong (Nan) en onaktiewe (Iav) - kan heteroloë kanale (Nan-Iav) vorm en lokaliseer na meganosensoriese organe wat geotropisme, gehoor en propriosepsie in insekte bemiddel. Sommige plaagdoders, soos aphidopirrolidoon (AP), teiken Nan-Iav deur onbekende meganismes. AP is effektief teen deurdringende suigende insekte (hemiptera), wat voeding voorkom deur die funksie van die filamente te ontwrig. AP kan slegs aan Nan bind, maar slegs Nan-Iav kan met agoniste, insluitend endogene nikotienamied (NAM), interaksie hê, en sodoende kanaalaktiwiteit vertoon. Ten spyte van Nan-Iav se potensiaal as 'n insekdoder-teiken, is min bekend oor die kanaalsamestelling, regulatoriese bindingsplekke en Ca2+-afhanklike regulering, wat verdere insekdoderontwikkeling belemmer. In hierdie studie is krio-elektronmikroskopie gebruik om die struktuur van Nan-Iav in Hemiptera-insekte in die kalmodulien-ligand-vrye toestand te bepaal, sowel as met AP en NAM by die grens van die ankyrien-herhalings-sitoplasmiese domein (ARD). Verrassend genoeg het ons gevind dat die Nan-proteïen self 'n pentameer kan vorm, wat gestabiliseer word deur AP-gemedieerde ARD-interaksies. Hierdie studie onthul molekulêre interaksies tussen insekdoders en agoniste en Nan-Iav, wat die belangrikheid van ARD in kanaalfunksie en -samestelling beklemtoon, en die meganisme van Ca2+-regulering ondersoek.
Teen die agtergrond van toenemend ernstige globale klimaatsverandering, is verslegtende globale voedselsekerheid een van die grootste uitdagings van die 21ste eeu, met watervalgevolge vir die samelewing.1,2Die Wêreldgesondheidsorganisasie se verslag oor die toestand van voedselsekuriteit en voeding in die wêreld 2023 (SOFI) beraam dat ongeveer 2,33 miljard mense wêreldwyd aan matige tot ernstige voedselonsekerheid ly, 'n langdurige probleem.3,4Ongelukkig word daar beraam dat 20% tot 30% of meer van gewasopbrengste jaarliks aan plae en patogene verlore gaan, en daar word verwag dat aardverwarming plaagweerstand en gewaskwesbaarheid sal vererger.4,5,6,7,8Die ontwikkeling van plaagdoders is van kritieke belang, nie net om gewasse teen plae te beskerm en die verspreiding van vektorgedraagde patogene te verminder nie, maar ook om vektorgedraagde menslike siektes soos denguekoors, malaria en Chagas-siekte te bestry, wat toenemend bestand is teen plaagdoders.5,9,10,11
Onder die hoofteikens van neurotoksiese insekdoders verteenwoordig die heterotetrameriese TRPV-kanaal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) 'n klas insekdoderteikens wat eers in die laaste dekade ontdek is, insluitend kommersieel beskikbare insekdoders soos imidakloprid en piraklostrobien.12,13,14Die semisintetiese insekdoder aphidopirrolifen (AP) is 'n onlangs ontwikkelde en gekommersialiseerde produk waarvan die hoofkomponent die aktiewe insekdoder Inscalis® is, wat AP op 'n subnanomolêre aktiwiteitsvlak bind.15AP toon lae akute toksisiteit vir bestuiwers, voordelige insekte en ander nie-teikenorganismes, en wanneer dit volgens etiketinstruksies gebruik word, kan dit weerstand teen ander insekdoders verminder.16,17,18Nan en Iav is wyd versprei oor insekspesies, word slegs saam uitgedruk in koordstrekreseptorneurone van die antennas en ledemate, en is krities vir gehoor, swaartekragpersepsie en propriosepsie.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid en piraklostrobien stimuleer die Nan-Iav-kompleks deur 'n unieke meganisme, wat uiteindelik proprioseptiewe seintransduksie inhibeer.13,16,23By deurdringende-suigende insekte (hemiptera) soos plantluise en witvlieë, benadeel die verlies aan propriosepsie hul voedingsvermoë, wat uiteindelik tot die dood lei.13,24Interessant genoeg toon AP hoë affiniteit vir die Nan-Iav-kompleks en lae affiniteit vir Nan alleen. Binding van AP aan Nan-Iav veroorsaak 'n elektriese stroom, maar binding aan Nan alleen stimuleer nie kanaalaktiwiteit nie. Iav self bind glad nie aan AP nie.16Dit dui daarop dat Nan en Iav moontlik bind om verskillende Nan-Iav-kanaalkomplekse te vorm (bv. met verskillende stoïgiometriese verhoudings of verskillende rangskikkings binne dieselfde stoïgiometriese verhouding) of dat AP aan verskeie plekke kan bind. Verder bind die natuurlike agonis nikotienamied (NAM) aan Drosophila Nan-Iav met mikromolêre affiniteit, wat effekte soortgelyk aan dié van plantluise (AP) in vitro toon.16,25en die inhibeer van plantluise se voortplanting en voeding, wat uiteindelik tot hul dood lei25,26Hierdie data laat baie vrae ontstaan. Dit bly byvoorbeeld onduidelik hoe die Nan-Iav-heterodimeer gevorm word, watter bindingsplekke gebruik word om klein molekules te moduleer, en hoe hierdie klein molekules kanaalfunksie reguleer deur propriosepsie te onderdruk. Verder bly die redes waarom Nan self onaktief is en 'n lae affiniteit vir AP het, terwyl die Nan-Iav-heterodimeer aktief is en AP met hoër affiniteit bind, onduidelik. Laastens is min bekend oor die Ca2+-afhanklike regulering van Nan-Iav-funksie en hoe dit in neuronale seinprosesse geïntegreer word.. 13,21
In hierdie studie, deur krio-elektronmikroskopie, elektrofisiologie en radioligandbindingstegnieke te kombineer, het ons die samestelling van Nan-Iav en die meganisme van die binding daarvan aan kleinmolekulereguleerders opgeklaar. Verder het ons konstitutief gebonde kalmodulien (CaM) aan Iav en AP-gestabiliseerde Nan-pentamere opgespoor. Hierdie resultate bied belangrike insigte in die regulering van kalsiumione in kanale, kanaalsamestelling en die faktore wat ligandbindingsaffiniteit bepaal. Meer belangrik, ons het bevestig dat ARD 'n sentrale rol in hierdie prosesse speel. Ons studie van volledige insekkanale gebind aan relevante landbouplaagdoders.27, 28, 29Dit skep vooruitsigte vir die ontwikkeling van die plaagdoderbedryf, verbeter die doeltreffendheid en spesifisiteit van plaagdoders, en maak die toediening van TRPV-geteikende verbindings op ander spesies moontlik om wêreldwye voedselsekerheid en die verspreiding van vektorgedraagde siektes aan te spreek.
Ons het ook gevind dat Nan-Iav deur Ca2+ gereguleer word, en die meganisme van regulering word gemedieer deur konstitutief gebonde CaM. Dit is belangrik dat hierdie Ca2+-afhanklike regulering van Nav deur CaM aansienlik verskil van die meganismes van regulering van ander ioonkanale (bv. spanningsafhanklike Na+-kanale en TRPV5/6-kanale).52,53,54,55,56,57In die Nav1.2-kanaal assosieer die C-terminale domein van CaM helies met die C-terminale domein (CTD), en Ca2+ veroorsaak binding van sy N-terminale domein aan die distale gedeelte van die CTD.56In die TRPV5/6-kanaal bind die C-terminale domein van CaM aan CTH, en Ca2+ veroorsaak opwaartse uitbreiding van sy N-terminale domein in die porie, waardeur katioondeurlaatbaarheid geblokkeer word.53,54Ons stel 'n model voor vir die Ca2+-gereguleerde funksie van Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). In hierdie model bind die N-terminale domein van CaM konstitutief aan die C-terminale domein (CTH) van Iav. In die rustende toestand (lae [Ca2+] konsentrasie) tree die C-terminale domein van CaM in wisselwerking met Nan, wat die ARD-konformasie stabiliseer en sodoende kanaalopening bevorder. Binding van 'n agonis/insekdoder aan die kanaal veroorsaak porie-opening, wat lei tot Ca2+-invloei. Ca2+ bind dan aan CaM, wat dissosiasie van die C-terminale domein van die ARD van Nan veroorsaak. Omdat die blokkering van CaM-binding in wese die inhiberende effek van Ca2+ afskaf, moduleer hierdie dissosiasie ARD-mobiliteit, wat sodoende Ca2+-afhanklike inhibisie of desensibilisering veroorsaak. Die vinnige herstel van kanaalstrome na kalsiumioon-eluering (Fig. 4g) dui daarop dat hierdie meganisme vinnige reaksies op Ca2+-gemedieerde neuronale seine fasiliteer. Verder is berig dat die C-terminale streek van Iav, wat steeds swak verstaan word, ander rolle in kanaalteikenstelling en huidige regulering speel.21
Laastens bied ons studie die hoëresolusie-struktuur van 'n insekdoder-insekdoder TRP-kanaalkompleks van landboukundige belang aan – 'n ontdekking wat voorheen vir ons onbekend was. Dit is veral belangrik dat ons die struktuur en funksie van die insekkanaal in menslike selle (HEK293S GnTi–) gekarakteriseer het eerder as in insekselle. In die lig van groeiende insekdoderweerstand en voortdurende druk op voedselsekerheid en patogene, verskaf ons werk belangrike inligting wat die ontwikkeling van nuwe insekdoders tot voordeel van menslike gesondheid en globale voedselsekerheid sal fasiliteer. Studies het getoon dat insekdoders soos AP effektief is teen sommige plae wanneer dit volgens etiketinstruksies gebruik word en lae akute toksisiteit vir voordelige bestuiwers het, wat hul omgewingsveiligheid demonstreer.13,16Verder het toetsing van sommige AP-derivate op muskiete getoon dat hulle uiteindelik hul vermoë om te vlieg verloor. Om te verstaan hoe hierdie modulerende verbindings aan Nan-Iav bind, sal die modifikasie van bestaande verbindings of die ontwikkeling van nuwe verbindings vir meer effektiewe enpresiesplaagbeheer. Ons studie toon dat die Nan-Iav ARD-koppelvlak nie net krities is vir die regulering van die aktiwiteit van endogene verbindings, plaagdoders en Ca2+-CaM nie, maar ook vir kanaalsamestelling. Ons stel voor dat die ontwrigting van heterodimeersamestelling met klein molekules 'n unieke en belowende benadering vir die ontwikkeling van ioonkanaalinhibeerders kan wees.
Van die agt ortoloë gene is die vollengte gene van die bruin kewer (Halyomorpha halys) Nanchung en Inactive gekies, wat uitstekende stabiliteit in skoonmaakmiddels toon. Die gesintetiseerde gene is kodon-geoptimaliseer vir menslike uitdrukking en gekloon in die pBacMam pCMV-DEST vektor (Life Technologies) met behulp van XhoI en EcoRI restriksieplekke. Dit het verseker dat die klone in lyn was met die C-terminale GFP-FLAG-10xHis en mCherry-FLAG-10xHis etikette, wat deur HRC-3C protease (PPX) geklief word, wat onafhanklike ... moontlik maak.uitdrukkingDie primers wat gebruik is om Nanchung en Inactive in die pBacMam-vektor te kloon, was soos volg:
Mikroskopiese beelde van individuele deeltjies is verkry op 'n Titan Krios G2 transmissie-elektronmikroskoop (FEI) toegerus met 'n K3-kamera en 'n Gatan BioQuantum-energiefilter. Die mikroskoop is bedryf teen 300 keV, met 'n energie-instelling van 20 eV, 'n monsterpixelgrootte van 1.08 Å/pixel (nominale vergroting van 81 000x), en 'n defokusgradiënt wat wissel van -0.8 tot -2.2 μm. Video-opname is uitgevoer teen 40 rame per sekonde met behulp van 'n Latitude S-mikroskoop (Gatan) met 'n nominale dosistempo van 25 e–px−1 s−1, 'n blootstellingstyd van 2.4 s, en 'n totale dosis van ongeveer 60 e–Å−2.
Straalgeïnduseerde bewegingskorreksie en dosisgewig is op film uitgevoer met behulp van MotionCor2 in RELION 4.061. Kontrasoordragfunksie (CTF) parameterberaming is in cryoSPARC uitgevoer met behulp van die kol-gebaseerde CTF-beramingsmetode62. Fotomikrograwe met 'n CTF-passingsresolusie ≥4 Å is van daaropvolgende analise uitgesluit. Tipies is 'n subgroep van 500–1000 fotomikrograwe gebruik vir puntseleksie in cryoSPARC, gevolg deur verskeie rondes van 2D-klassifikasie na filtrering om 'n duidelike verwysingsbeeld vir sjabloongebaseerde deeltjieseleksie te verkry. Deeltjies is toe onttrek met behulp van 64-pixel-begrensbokse en 4-voudige binning. Verskeie rondes van 2D-klassifikasie is uitgevoer om ongewenste deeltjiekategorieë te verwyder. Die aanvanklike 3D-model is gerekonstrueer met behulp van ab initio-rekonstruksie en verfyn met behulp van nie-uniforme verfyning in cryoSPARC. 3D-klassifikasie is in cryoSPARC of RELION uitgevoer gebaseer op ARD-heterogeniteit. Geen beduidende heterogeniteit van membraandomeine is waargeneem nie. Deeltjies is verfyn met behulp van die C1- en C2-metodes; Deeltjies met hoër C2-resolusie is as simmetries ten opsigte van C2 beskou en in RELION ingevoer vir Bayesiaanse verfyning. Die deeltjies is toe terug oorgedra na cryoSPARC vir finale nie-uniforme en lokale verfyning. Die finale resolusie en deeltjietellings word in Tabel 1 getoon.
Tydens die verwerking van Nan+AP-pentamere het ons verskeie metodes ondersoek om die resolusie van membraandomeine (veral die poriegebied) te verbeter, soos seinaftrekking en TMD-maskering. Hierdie pogings was egter onsuksesvol as gevolg van die potensieel uiterste wanorde in die poriegebied en die algehele heterogeniteit van die TMD. Die finale resolusie is bereken met behulp van 'n masker wat outomaties gegenereer is deur die nie-uniforme verwerkingsmetode in cryoSPARC, hoofsaaklik gemik op die ARD-gebied. Dit het aansienlik hoër resolusie behaal as dié van die membraandomeine (veral die VSLD-gebied).
Aanvanklike de novo-modelle van die apo-vorme van die Nanchung- en Inaktiewe-kewers is eers gegenereer met behulp van Coot63, en modelle van die Nan- en Iav-kewers is gegenereer met behulp van AlphaFold264 om lae-betroubaarheidsgebiede te identifiseer. Kalmodulien-modellering was gebaseer op rigiede-liggaampassings van die Ca2+-bindende en Ca2+-vrye modelle in PDB-toegangse 4JPZ56 en 1CFD65, onderskeidelik. Die modelle is verfyn met behulp van sferiese verfyning om die korrekte stereochemie en goeie geometrie te verseker. Fosfatidielcholien, fosfatidieletanolamien en fosfatidielserien is toe gemodelleer as goed gedefinieerde lipieddigthede, en die NAM- en AP-ligande is in die ooreenstemmende digthede in die stywe verbindings geplaas. Beperkingslêers is gegenereer uit die SMILES-string van die isovorme met behulp van eLBOW in PHENIX66. Laastens is die modelle in werklike ruimte in PHENIX verfyn met behulp van plaaslike roostersoektog en globale minimalisering met sekondêre struktuurbeperkings. Die MolProbity-bediener is gebruik vir modelverfyning en strukturele analise, en illustrasies is uitgevoer met behulp van PyMOL en UCSF Chimera X. 67,68,69 Apertuuranalise is uitgevoer met behulp van die HOLE-bediener,70 en volgordebewaringskartering is uitgevoer met behulp van die Consurf-bediener.71
Statistiese analise is uitgevoer met behulp van Igor Pro 6.2, Excel Office 365 en GraphPad Prism 7.0. Alle kwantitatiewe data word aangebied as gemiddelde ± standaardfout (SEM). Student se t-toets (tweesydig, ongepaar) is gebruik om twee groepe te vergelyk. Eenrigting-variansie-analise (ANOVA) gevolg deur Dunnett se post hoc-toets is gebruik om verskeie groepe te vergelyk. *P< 0.05, **P< 0.01, en ***P< 0.001 is as statisties beduidend beskou, afhangende van die dataverspreiding. Kd-, Ki-waardes en hul asimmetriese 95%-vertrouensintervalle is bereken met behulp van GraphPad Prism 10.
Vir meer besonderhede oor die studiemetodologie, sien asseblief die Natuurportefeuljeverslagopsomming wat in hierdie artikel gekoppel is.
Die aanvanklike model is gebou met behulp van die kalmodulienmodelle van die PDB 4JPZ- en 1CFD-databasisse. Die koördinate is in die Proteïendatabank (PDB) gedeponeer onder toetredingsnommers 9NVN (Nan-Iav-CaM sonder ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM gebind aan nikotienamied), 9NVP (Nan-Iav-CaM gebind aan nikotienamied en EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM gebind aan afenidolpirrolline en kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM gebind aan afenidolpirrolline en EDTA), en 9NVS (Nan-pentameer gebind aan afenidolpirrolline). Die ooreenstemmende krio-elektronmikroskopiebeelde word in die Elektronmikroskopiedatabasis (EMDB) onder die volgende toetredingsnommers gedeponeer: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sonder ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-kompleks met nikotienamied), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-kompleks met nikotienamied en EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-kompleks met aphidopirrolline en kalsium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-kompleks met aphidopirrolline en EDTA), en EMD-49849 (Nan-pentameerkompleks met aphidopirrolline). Die rou data vir die funksionele analise word in hierdie artikel aangebied.
Plasingstyd: 28 Januarie 2026